Kwantitatieve beoordeling van Human migratie van neutrofielen door een Gekweekte blaas epitheel
Summary
We ontwikkelden een in vitro model dat een belangrijke component van de acute ontstekingsreactie tijdens infectie van de blaas uropathogene Escherichia coli nabootst. De transuroepithelial neutrofiel migratie assay maakt kwantitatieve beoordeling van menselijke neutrofiel migratie over blaas epitheel, gekweekt op permeabele dragers, in reactie op bacteriële infectie of chemoattractant stoffen.
Abstract
De rekrutering van immuuncellen van de periferie naar de plaats van ontsteking is een essentiële stap in de aangeboren immuunrespons op elk slijmvliesoppervlak. Tijdens infectie van de urineblaas, polymorfonucleaire leukocyten (PMN, neutrofielen) migreren van de bloedsomloop en beweeg de blaas epitheel. Het niet-infectie op te lossen in de afwezigheid van een neutrofiele respons toont het belang van PMN in blaas verdediging. Kolonisatie van de blaas epitheel, uropathogene Escherichia coli (UPEC) te vergemakkelijken, de verwekker van de meerderheid van urineweginfecties (UWI), temperen de acute ontstekingsreactie behulp van een verscheidenheid van gedeeltelijk gedefinieerd mechanismen. Om de wisselwerking tussen gastheer en bacteriële pathogenen te onderzoeken, een in vitro model van dit aspect van de aangeboren immuunrespons op UPEC ontwikkeld. In de transuroepithelial neutrofielen migratie assay, een variatie op de Boyden-kamer, gekweekte blaas epithElial cellen worden gekweekt tot confluentie op de onderzijde van een doorlaatbare drager. PMN worden geïsoleerd uit menselijk veneus bloed en worden toegepast op de basolaterale zijde van de blaas epitheel cellagen. PMN migratie die de fysiologisch relevante basolaterale naar apicale richting in reactie op bacteriële infectie of chemo-aantrekkende moleculen opgesomd met behulp van een hemocytometer. Dit model kan worden gebruikt om de interacties tussen UPEC en eukaryotische cellen te onderzoeken alsook de moleculaire vereisten voor traversal van blaas epitheel ondervragen door PMN. De transuroepithelial neutrofiel migratiemodel ons begrip van de initiële ontstekingsreactie op UPEC in de blaas bevorderen.
Introduction
De beweging van cellen in het lichaam, vaak over grote afstanden, is nodig voor de groei en ontwikkeling, wondgenezing en immuunrespons. Celmigratie is complex en vereist de coördinatie van verschillende processen, waaronder signaal transductie en herschikking van cytoskelet componenten. Cellen kunnen willekeurig evenals bewegen (chemokinesis) richting gedefinieerde chemische gradiënten (chemotaxis). Vele technieken zijn ontwikkeld om celmigratie in vitro bestuderen. De oudste en meest gebruikte techniek, de Boyden-kamer, bestaande uit een verticaal tweekamersysteem waarbij een chemoattractant stof wordt in de onderste kamer en cellen van belang worden geplaatst in de bovenste kamer 1. De beweging van cellen in de permeabele filter met poriën van gedefinieerde grootte, die de twee kamers wordt bewaakt. Aanvullende technieken ontwikkeld om celmigratie te onderzoeken, waaronder Zigmond kamer 2 en kamer Dunn3. Deze collectieve benaderingen hebben aanzienlijke inzicht in de beweging van vele verschillende celtypes opgeleverd.
Naast ondervragen de basisprincipes van chemokinesis en chemotaxis, zijn twee kamers assays onderzoek van celmigratie door extracellulaire matrixcomponenten en zowel endotheliale en epitheliale lagen vergemakkelijkt. Een voordeel van twee-kamer systemen via andere technieken is dat het poreuze membraan kan worden bekleed met eiwitten zoals collageen of fibrinogeen, en celmigratie in een extracellulaire matrix-achtige barrière kan worden beoordeeld. Daarnaast kunnen gekweekte cellijnen worden gekweekt en gedifferentieerd op permeabele steunen. Om de beweging van cellen in de endotheliale barrière te onderzoeken, worden gekweekte endotheelcellen gezaaid en gekweekt in het bovenste reservoir van de permeabele steunen. Beweeglijke cellen, zoals immuuncellen, toegevoegd aan het bovenste reservoir en migratie in het onderste reservoir en in dedothelial barrière in de fysiologische apicale-to-basolaterale richting wordt waargenomen. Dit model is van onschatbare waarde geweest bij het begrijpen van extravasatie van immuuncellen uit het bloed. In tegenstelling tot transendotheliale migratie, de beweging van cellen in een epitheliale barrière treedt meestal in de basolaterale naar apicale richting. Om modelleren deze gebeurtenissen in vitro onderzoekers zaad en groeien gekweekte epitheelcellen aan de onderzijde van de permeabele steunen. Beweeglijke cellen worden toegevoegd aan het bovenste reservoir en migratie over de epitheliale barrière, die de basolaterale naar apicale richting bewaakt. Dergelijke modellen van transepitheliaal migratie hebben aanzienlijk bijgedragen aan ons begrip van ontstekingsreacties op mucosale oppervlakken, in het bijzonder die van de long en darm 4,5.
In tegenstelling, is immuun cel mensenhandel door het epitheel van de urinewegen veel minder aandacht gekregen. Om onze understandi verderng aangeboren immuunrespons bij de urinewegen tijdens infectie met uropathogene Escherichia coli (UPEC), ontwikkelden we een in vitro test, de transuroepithelial neutrofielen migratie assay, dat onderzoek van polymorfonucleaire leukocyten maakt (PMN; neutrofielen) beweging over een blaas epitheelbarrière 6 -8. Zoals bij andere twee kamers modellen transepitheliale migratie worden gekweekte menselijke blaas epitheelcellen gegroeid op de onderzijde van een doorlaatbare steun en vormen confluente epitheliale lagen. Menselijke neutrofielen, geïsoleerd uit veneus bloed, worden aangebracht op de basolaterale zijde van de epitheliale laag en migratie over het epitheel van de fysiologisch relevante basolaterale naar apicale richting wordt gekwantificeerd in reactie op infectie door verschillende stammen van E. coli of de aanwezigheid van chemoattractant moleculen. Veel onderzoek was gericht op neutrofielen beweging, zowel chemokinesis en chemotaxis, bij het ontbreken van extra celtypes. De transuroepithelial neutrofielen migratie test is voordelig omdat het rekening houdt met de complexe interacties tussen de blaas epitheel cellen en immuuncellen tijdens infectie. Deze soepele in vitro model heeft het potentieel om de gedetailleerde onderzoek immuunrespons uroepithelial oppervlakken mogelijk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met behulp van een gekweekte blaas epitheelcellijn en vers geïsoleerde humane PMN, hebben we een in vitro model van transuroepithelial neutrofielmigratie. Dit model is behulpzaam geweest bij het begin tot de complexiteit van de aangeboren immuunrespons tijdens infectie van de urinewegen (UTI), een zeer veel voorkomende bacteriële infectie meestal veroorzaakt door UPEC 9 ontleden geweest. Tijdens blaasontsteking of cystitis, werving van PMN aan de blaas lumen is essentieel voor bacteriële ver…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) verleent R01-DK080752 en P50-DK064540. Wij danken J. Loughman voor haar inspanningen bij de vaststelling van deze test.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Transwell Inserts (i.e. permeable supports) | Corning | 3472 | 6.5 mm, 3 μm pore, polyester membrane insert |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes | Becton, Dickinson and Company (BD) | 366480 | 16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin |
| BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set | Becton, Dickinson and Company (BD) | 367281 | 21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing |
| BD Vacutainer one-use, nonstackable holder | Becton, Dickinson and Company (BD) | 364815 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | From Leuconostoc mesenteroides |
| Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Ultra-Low Attachment Plates | Corning | 3473 | 24-well, clear flat bottom |
| N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) | Sigma-Aldrich | F3506 | Reconstituted in DMSO to 10 mM |
| Recombinant Human CXCL8/IL-8 | R&D Systems | 208-IL | Reconstituted in PBS to 100 μg/ml |
References
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Zigmond, S. H. Orientation chamber in chemotaxis. Methods Enzymol. 162, 65-72 (1988).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J. Cell Sci. 99 (Pt. 4), 769-775 (1991).
- Chin, A. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury. Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).
- Zemans, R. L., Colgan, S. P., Downey, G. P. Transepithelial migration of neutrophils: mechanisms and implications for acute lung injury. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 40, 519-535 (2009).
- Loughman, J. A., Hunstad, D. A. Attenuation of human neutrophil migration and function by uropathogenic bacteria. Microbes Infect. 13, 555-565 (2011).
- Lau, M. E., Loughman, J. A., Hunstad, D. A. YbcL of uropathogenic Escherichia coli suppresses transepithelial neutrophil migration. Infect. Immun. 80, 4123-4132 (2012).
- Loughman, J. A., Hunstad, D. A. Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase by uropathogenic bacteria attenuates innate responses to epithelial infection. J. Infect. Dis. 205, 1830-1839 (2012).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nat. Rev. Urol. 7, 653-660 (1038).
- Haraoka, M., et al. Neutrophil recruitment and resistance to urinary tract infection. J. Infect. Dis. 180, 1220-1229 (1999).
- Billips, B. K., et al. Modulation of host innate immune response in the bladder by uropathogenic Escherichia coli. Infect. Immun. 75, 5353-5360 (2007).
- Bozeman, P. M., Learn, D. B., Thomas, E. L. Assay of the human leukocyte enzymes myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. J. Immunol. Methods. 126, 125-133 (1990).
- Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. In vitro neutrophil transepithelial migration. Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).
- Säve, S., Mohlin, C., Vumma, R., Persson, K. Activation of adenosine A2A receptors inhibits neutrophil transuroepithelial migration. Infect. Immun. 79, 3431-3437 (2011).
- Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism. Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nat. Protoc. 4, 1230-1243 (2009).
