Kvantitativ vurdering av Menneskelig Neutrophil Migration Across en kultivert Blære Epitel

Summary

Vi har utviklet en in vitro-modell som etterligner en viktig komponent i den akutte betennelsesresponsen under infeksjon av blæren med uropathogenic Escherichia coli. Den transuroepithelial nøytrofil migrering analysen muliggjør kvantitativ vurdering av human neutrofil migrering over blæren epitel, kultivert på gjennomtrengelige bærere, som reaksjon på bakteriell infeksjon eller kjemotiltrekkende stoffer.

Abstract

Rekrutteringen av immunceller fra periferien til stedet av betennelse er et viktig skritt i det medfødte immunrespons til enhver slimhinneoverflaten. Under infeksjon i urinblæren, polymorfnukleære leukocytter (PMN, nøytrofile) migrere fra blodet og traversere blæren epitel. Unnlatelse av å løse infeksjon i fravær av en nøytrofil respons demonstrerer viktigheten av PMN i blæren forsvar. For å lette kolonisering av blæren epitel, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), den utløsende agent for de fleste urinveisinfeksjoner (UVI), dempe den akutte betennelsesreaksjon ved hjelp av en rekke delvis definerte mekanismer. For ytterligere å undersøke samspillet mellom verten og bakteriell patogen, har vi utviklet en in vitro modell av dette aspektet av den medfødte immunrespons til UPEC. I transuroepithelial nøytrofile migrasjon analysen, en variant på Boyden kammer, kultivert blære epithelial celler blir dyrket til konfluens på undersiden av en permeabel støtte. PMN blir isolert fra humant venøst ​​blod, og er anvendt på basolateral side av blæren epiteliale cellelagene. PMN migrering representerer fysiologisk relevant basolateral-til-apikal retning som reaksjon på bakteriell infeksjon eller kjemotiltrekkende molekyler er nummerert ved hjelp av et hemocytometer. Denne modellen kan brukes til å undersøke samspillet mellom UPEC og eukaryote celler samt å avhøre de molekylære krav til traversering av blæren epitel av PMN. Den transuroepithelial nøytrofile migrasjon modellen vil videreutvikle vår forståelse av den innledende betennelsesreaksjon til UPEC i blæren.

Introduction

Bevegelsen av celler i hele kroppen, ofte over lange avstander, er nødvendig for vekst og utvikling, sårheling og immunrespons. Celle migrasjon er komplekse og krever samordning av mange ulike prosesser, herunder signal kaskader og omorganisering av cytoskeletal komponenter. Celler kan flytte tilfeldig (chemokinesis) samt mot definerte kjemiske gradienter (kjemotaksis). Mange teknikker har blitt utviklet for å studere cellemigrering in vitro. Den eldste og mest vanlige teknikk, Boyden kammer, består av en vertikal to-kammersystem hvor en kjemoattraktant substans er plassert i bunnkammeret og celler av interesse er plassert i den øverste kammeret ^1. Bevegelsen av cellene på tvers av gjennomtrengelige filter med porer av definert størrelse, separering av de to kamre er overvåket. Andre teknikker har blitt utviklet for å undersøke cellemigrasjon, inkludert Zigmond kammeret ² og Dunn kammeret^Tre. Disse kollektive tilnærminger har gitt betydelig innsikt i bevegelsen av mange forskjellige celletyper.

I tillegg til å avhøre de grunnleggende prinsippene for chemokinesis og kjemotaksis, har to-kammer analyser tilrettelagt etterforskningen av cellemigrasjon gjennom ekstracellulære matrix komponenter og både endothelial og epiteliale cellelagene. En fordel med to-kammer-systemer i forhold til andre teknikker, er at den porøse membran kan være belagt med proteiner som kollagen og fibrinogen, og cellemigrasjon på tvers av en ekstracellulær matriks-lignende barriere kan vurderes. I tillegg kan dyrkede cellelinjer dyrkes og differensieres på permeable støtter. For å undersøke bevegelsen av cellene over en endotelisk barriere, er dyrkede endoteliale celler utsådd og dyrket i det øvre reservoar av de gjennomtrengelige bærere. Bevegelige celler, slik som immunceller, tilsettes til det øvre reservoar, og migrering inn i det nedre reservoar over endothelial barriere i den fysiologiske apikal-til-basolateral retning er observert. Denne modellen har vært uvurderlig i å forstå bloduttredelse av immunceller ut av blodet. I motsetning til transendothelial migrasjon, bevegelse av cellene over en epitelial barrieren oppstår typisk i basolateral-til-apikal retning. For å modellere slike hendelser in vitro, forskere frø og vokse dyrkede epitelceller på undersiden av den gjennomtrengelige bærere. Motile celler blir tilsatt til det øvre reservoar, og migreringen tvers av epiteliale barriere, som representerer den basolateral-til-apikal retning, blir overvåket. Slike modeller av transepithelial migrasjon har bidratt vesentlig til vår forståelse av betennelsesreaksjoner på slimhinner, spesielt de av lunge og gut ^4,5.

I kontrast, har immunceller menneskehandel gjennom epitelet i urinveiene fått mye mindre oppmerksomhet. For å videreutvikle vår understanding av medfødte immunresponser i urinveiene under infeksjon med uropathogenic Escherichia coli (UPEC), utviklet vi en in vitro assay, den transuroepithelial nøytrofile migrasjon analysen, som gjør at etterforskningen av polymorfonukleære leukocytter (PMN, nøytrofile) bevegelse over en blære epiteliale barriere ^{6 -8.} Som med andre to-kammer-modeller av transepithelial migrasjon, blir dyrkede humane blære epitelceller dyrket på undersiden av en permeabel støtte og danner konfluente epiteliale lag. Humane nøytrofiler, isolert fra venous blod, påføres den basolateral side av epitellaget, og migrasjon på tvers av epitelet i fysiologisk relevant basolateral-til-apikal retningen er kvantifisert som svar på infeksjon med forskjellige stammer av E. coli-eller i nærvær av chemoattractant molekyler. Mye forskning har fokusert på nøytrofil bevegelse, både chemokinesis og chemotaxis, i fravær av andre celletyper. Den transuroepithelial nøytrofile migrasjon analysen er en fordel som det tar hensyn til komplekse interaksjoner mellom blære epitelceller og immunceller under infeksjon. Dette medgjørlig in vitro modell har potensial til å tillate detaljert undersøkelse av immunresponser ved uroepithelial overflater.

Protocol

En. Dyrkning 5637 Blære Epitelceller Utfør følgende trinn i en laminær vev-kultur hette forberedt med UV-bestråling og tørkes ned med 70% etanol. Forbered RPMI-1640 medium inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) [betegnet RPMI +], filtersteriliser ved hjelp av et 0,22 mikrometer porestørrelse filter, og varm til 37 ° C i et vannbad. Tin en cryovial av 5637-celler (American Type Culture Collection HTB-9; avledet fra blære karsinom) i et 37 ° C vannbad. Raskt…

Representative Results

Den transuroepithelial nøytrofil migrering analysen muliggjør kvantitativ vurdering av human PMN migrasjon over dyrkede blære epitelial cellelagene i respons til forskjellige stimuli (figur 1B). Mens protokoll er enkel, er det et antall variabler som kan påvirke PMN migrasjon og følgelig påvirker reproduserbarheten av denne analysen. Tiltak bør tas ved utarbeidelsen av permeable støtter og den PMN å redusere variasjonen mellom tekniske og biologiske replikater. For eksempel bør bare permeable …

Discussion

Ved hjelp av en kultivert blære epitelial cellelinje og fersk isolert human PMN, etablerte vi en in vitro modell av transuroepithelial nøytrofile migrasjon. Denne modellen har vært instrumental i ferd med å dissekere kompleksiteten i det medfødte immunrespons under urinveisinfeksjon (UVI), en svært vanlig bakteriell infeksjon vanligvis forårsaket av UPEC ^ni. Ved infeksjon av blæren, eller cystitt, er avgjørende for bakteriell klaring ¹⁰ rekruttering av PMN til blæren lumen. Å et…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Transwell Inserts (i.e. permeable supports)	Corning	3472	6.5 mm, 3 μm pore, polyester membrane insert
BD Vacutainer Blood Collection Tubes	Becton, Dickinson and Company (BD)	366480	16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin
BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set	Becton, Dickinson and Company (BD)	367281	21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing
BD Vacutainer one-use, nonstackable holder	Becton, Dickinson and Company (BD)	364815
Dextran	Sigma-Aldrich	D4876	From Leuconostoc mesenteroides
Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution	GE Healthcare	17-1440-02
Ultra-Low Attachment Plates	Corning	3473	24-well, clear flat bottom
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)	Sigma-Aldrich	F3506	Reconstituted in DMSO to 10 mM
Recombinant Human CXCL8/IL-8	R&D Systems	208-IL	Reconstituted in PBS to 100 μg/ml