Avaliação quantitativa de neutrófilos humanos migração através de um Cultivadas bexiga Epitélio

Summary

We developed an in vitro model that mimics an important component of the acute inflammatory response during infection of the bladder with uropathogenic Escherichia coli. The transuroepithelial neutrophil migration assay enables quantitative assessment of human neutrophil migration across bladder epithelia, cultured on permeable supports, in response to bacterial infection or chemoattractant substances.

Abstract

O recrutamento de células do sistema imunológico da periferia para o local da inflamação é um passo essencial na resposta imune inata a qualquer superfície mucosa. Durante a infecção da bexiga urinária, os leucócitos polimorfonucleares (PMN; neutrófilos) migram da corrente sanguínea e atravessar o epitélio da bexiga. A incapacidade de resolver a infecção, na ausência de uma resposta neutrofílica demonstra a importância de PMN em defesa da bexiga. Para facilitar a colonização do epitélio da bexiga, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), o agente causador da maioria das infecções do tracto urinário (ITU), atenuar a resposta inflamatória aguda, utilizando uma variedade de mecanismos parcialmente definidas. Para investigar ainda mais a interacção entre o hospedeiro eo agente patogénico bacteriano, foi desenvolvido um modelo in vitro do presente aspecto da resposta imune inata a UPEC. No ensaio de migração de neutrófilos transuroepithelial, uma variação na câmara de Boyden, epith bexiga cultivadasElial células são cultivadas até à confluência na parte inferior de um suporte permeável. PMN são isolados a partir de sangue venoso humano e são aplicados para o lado basolateral das camadas de células epiteliais da bexiga. Migração PMN representando a direcção basolateral-para-apical fisiologicamente relevante, em resposta a uma infecção bacteriana ou moléculas quimioatratantes é enumerada utilizando um hemocitómetro. Este modelo pode ser usado para investigar interacções entre UPEC e células eucarióticas, bem como para interrogar os requisitos moleculares para a passagem do epitélio da bexiga por PMN. O modelo de migração de neutrófilos transuroepithelial irá promover nossa compreensão da resposta inflamatória inicial para UPEC na bexiga.

Introduction

O movimento das células através do corpo, muitas vezes através de longas distâncias, é necessário para o crescimento e desenvolvimento, a cicatrização de feridas, e a resposta imune. A migração celular é complexo e requer coordenação de muitos processos diferentes, incluindo cascatas de sinalização e o rearranjo dos componentes do citoesqueleto. As células podem se mover de forma aleatória (quimiocinese), bem como para gradientes químicos definidos (quimiotaxia). Muitas técnicas têm sido desenvolvidas para estudar a migração celular in vitro. A técnica mais antiga e mais comum, a câmara de Boyden, que consiste num sistema de duas câmaras verticais, onde uma substância quimioatractiva é colocada na câmara inferior e as células de interesse são colocados na parte superior da câmara ^1. O movimento das células através do filtro permeável, com poros de tamanho definido, que separa as duas câmaras é controlada. Outras técnicas têm sido desenvolvidas para investigar a migração de células, incluindo a câmara de Zigmond ² e a câmara de Dunn^3. Estas abordagens coletivas produziram um panorama significativo para o movimento de muitos tipos celulares diferentes.

Além interrogar os princípios básicos da quimiocinese e quimiotaxia, ensaios de duas câmaras têm facilitado a investigação da migração de células através de componentes da matriz extracelular e as duas camadas de células endoteliais e epiteliais. Uma vantagem de sistemas de duas câmaras em relação a outras técnicas é que a membrana porosa pode ser revestida com proteínas tais como colagénio ou fibrinogénio, e a migração de células através de uma barreira de matriz extracelular, como pode ser apreciado. Além disso, as linhas de células cultivadas pode ser cultivada e diferenciado sobre os suportes permeáveis. Para investigar o movimento das células através de uma barreira endotelial, células endoteliais cultivadas são semeadas e cultivadas no reservatório superior dos suportes permeáveis. Células móveis, tais como células do sistema imunológico, são adicionados ao reservatório superior e a migração para dentro do reservatório inferior do outro lado da enbarreira endotelial no sentido fisiológico apical-para-basolateral é observada. Este modelo tem sido inestimável na compreensão de extravasamento de células do sistema imunológico para fora da corrente sanguínea. Em contraste com a migração transendotelial, o movimento das células através de uma barreira epitelial ocorre tipicamente no sentido basolateral-para-apical. A fim de modelar estas eventos in vitro, os investigadores sementes e crescer as células epiteliais cultivadas na parte inferior dos suportes permeáveis. Células móveis são adicionados ao reservatório superior e da migração através da barreira epitelial, que representa a direcção basolateral-para-apical, é monitorado. Tais modelos de migração transepitelial têm contribuído significativamente para a nossa compreensão de respostas inflamatórias na superfície das mucosas, principalmente os de pulmão e intestino ^4,5.

Em contraste, o tráfico de células imunitárias através do epitélio do tracto urinário tem recebido menos atenção. Para reforçar ainda mais a nossa understanding de respostas imune inata no trato urinário durante a infecção com uropatogênica Escherichia coli (UPEC), desenvolvemos um ensaio in vitro, o ensaio de migração de neutrófilos transuroepithelial, que permite a investigação de leucócitos polimorfonucleares (PMN; neutrófilos) o movimento através de uma barreira epitelial da bexiga ^{6 -8.} Tal como com outros modelos de duas câmaras de migração transepitelial, bexiga células epiteliais humanas cultivadas são crescidas na parte inferior de um suporte permeável e formar camadas epiteliais confluentes. Os neutrófilos humanos, isolados a partir de sangue venoso, são aplicados para o lado basolateral da camada epitelial, e migração através do epitélio na direcção basolateral-para-apical fisiologicamente relevante é quantificada em resposta à infecção por diferentes estirpes de E. coli ou a presença de moléculas de quimioatratantes. Muita investigação focou no movimento de neutrófilos, tanto quimiocinese e quimiotaxia, na ausência de tipos de células adicionais. O ensaio de migração de neutrófilos transuroepithelial é vantajosa, uma vez que leva em conta as interações complexas entre as células epiteliais da bexiga e células do sistema imunológico durante a infecção. Este modelo in vitro tratável tem o potencial de permitir a investigação aprofundada das respostas imunitárias em superfícies uroepiteliais.

Protocol

1. Culturing 5637 Bladder Epithelial Cells Perform the following steps in a laminar flow tissue-culture hood prepared with UV irradiation and wiped down with 70% ethanol. Prepare RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) [termed RPMI+], filter sterilize using a 0.22 µm pore size filter, and warm to 37 °C in a water bath. Thaw a cryovial of 5637 cells (American Type Culture Collection HTB-9; derived from bladder carcinoma) in a 37 °C water bat…

Representative Results

The transuroepithelial neutrophil migration assay enables the quantitative assessment of human PMN migration across cultured bladder epithelial cell layers in response to various stimuli (Figure 1B). While the protocol is straightforward, there are a number of variables that can influence PMN migration and consequently affect the reproducibility of this assay. Measures should be taken while preparing the permeable supports and the PMN to reduce variability between technical and biological replicates. For…

Discussion

Using a cultured bladder epithelial cell line and freshly isolated human PMN, we established an in vitro model of transuroepithelial neutrophil migration. This model has been instrumental in beginning to dissect the complexities of the innate immune response during urinary tract infection (UTI), an extremely common bacterial infection typically caused by UPEC⁹. During infection of the bladder, or cystitis, recruitment of PMN to the bladder lumen is essential for bacterial clearance¹⁰. To es…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Transwell Inserts (i.e. permeable supports)	Corning	3472	6.5 mm, 3 μm pore, polyester membrane insert
BD Vacutainer Blood Collection Tubes	Becton, Dickinson and Company (BD)	366480	16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin
BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set	Becton, Dickinson and Company (BD)	367281	21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing
BD Vacutainer one-use, nonstackable holder	Becton, Dickinson and Company (BD)	364815
Dextran	Sigma-Aldrich	D4876	From Leuconostoc mesenteroides
Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution	GE Healthcare	17-1440-02
Ultra-Low Attachment Plates	Corning	3473	24-well, clear flat bottom
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)	Sigma-Aldrich	F3506	Reconstituted in DMSO to 10 mM
Recombinant Human CXCL8/IL-8	R&D Systems	208-IL	Reconstituted in PBS to 100 μg/ml