Количественная оценка миграции нейтрофилов человека во культурный мочевого эпителия
Summary
Мы разработали модель в пробирке, который имитирует важный компонент острой воспалительной реакции во время инфекции мочевого пузыря с уропатогенных кишечной палочки. Transuroepithelial миграции нейтрофилов анализ позволяет количественно оценить человеческие миграции нейтрофилов через эпителий мочевого пузыря, культивировали на проницаемыми опор, в ответ на бактериальной инфекции или хемоаттрактант веществ.
Abstract
Вербовка иммунных клеток от периферии к месту воспаления является важным шагом в врожденного иммунного ответа на любой поверхности слизистой оболочки. Во время инфекции мочевого пузыря, полиморфноядерных лейкоцитов (ПМН; нейтрофилы) мигрируют из крови и пройдите через эпителий мочевого пузыря. Неспособность решить инфекции в отсутствие нейтрофильного ответ демонстрирует важность ПМН в защиту мочевого пузыря. Для облегчения колонизацию эпителия пузыря, уропатогенных кишечной палочки (УПЭК), возбудителем большинства инфекций мочевыводящих путей (ИМП), смочить острую воспалительную реакцию, используя различные частично определенных механизмов. Для дальнейшего исследования взаимосвязи между хостом и бактериальным патогеном, мы разработали модель в пробирке этого аспекта врожденного иммунного ответа к УПЭК. В transuroepithelial нейтрофилов анализа миграции, вариация на камеры Бойдена, культивируют epith мочевого пузыряelial клетки выращивают до слияния на нижней стороне проницаемой поддержки. PMN изолированы от венозной крови человека и применяются к базолатеральной стороне слоев эпителиальных клеток мочевого пузыря. PMN миграция, представляющая соответствующие физиологически базолатеральной к апикальной-направление в ответ на бактериальной инфекции или хемоаттрактант молекул перечисленных помощью гемоцитометра. Эта модель может быть использована для исследования взаимодействия между УПЭК и эукариотических клеток, а также допросить молекулярные требования к обхода эпителия мочевого пузыря по ПМН. Transuroepithelial миграции нейтрофилов модель будет углубить наше понимание начальной воспалительной реакции на УПЭК в мочевом пузыре.
Introduction
Движение клеток по всему организму, часто на большие расстояния, требуется для роста и развития, заживления ран и иммунного ответа. Миграция клеток является сложным и требует координации различных процессов, в том числе сигнальных каскадов и перестройка компонентов цитоскелета. Клетки могут двигаться случайным образом (хемокинез), а также к определенных химических градиентов (хемотаксиса). Многие методы были разработаны для изучения миграции клеток в пробирке. Самый старый и наиболее распространенный метод, камера Бойден, состоит из вертикального двухпалатной системы, где хемоаттрактант вещество помещается в нижнюю камеру и клеток, представляющих интерес размещены в верхней камере 1. Движение клеток через проницаемый фильтр с порами определенного размера, отделяя две камеры контролируется. Дополнительные методы были разработаны, чтобы исследовать миграцию клеток, в том числе камеры Zigmond 2 и камерой Dunn3. Эти коллективные подходы дали значительно углубить понимание движения различных типов клеток.
В дополнение к опрашивая основные принципы хемокинез и хемотаксис, двухкамерные анализы способствовали исследование миграции клеток через компонентами внеклеточного матрикса, и оба эндотелиальных и эпителиальных слоев клеток. Преимущество двухкамерных систем по сравнению с другими методами является то, что пористая мембрана может быть покрыта белков, таких как коллаген или фибриногена и миграции клеток через внеклеточного матрикса, как барьер может быть оценена. Кроме того, культивируемые клеточные линии могут быть выращены и дифференцированы на проницаемых опор. Чтобы исследовать движение клеток через барьер эндотелиальных, культивируемые эндотелиальные клетки высевают и выращивают в верхний резервуар проницаемых опор. Подвижные клетки, такие как клетки иммунной системы, будут добавлены в верхний резервуар и миграции в нижний резервуар через анэндотелиальных барьер в физиологическом направлении верхушечный-на-базолатеральная наблюдается. Эта модель была неоценима в понимании экстравазацию иммунных клеток из крови. В отличие от трансэндотелиальной миграцию, движение клеток через эпителиальный барьер обычно происходит в базолатеральной к апикальной-направлении. Для моделирования этих событий в пробирке, исследователи семян и растут культивируемых эпителиальных клеток на нижней проницаемых опор. Подвижных клеток добавляют в верхний резервуар и миграции через эпителиальный барьер, представляющий базолатеральной к апикальной направлении, находится под контролем. Такие модели трансэпителиальной миграции внесли значительный вклад в наше понимание воспалительных реакций в слизистых поверхностях, особенно легких и кишки 4,5.
В противоположность этому, оборот иммунных клеток через эпителий мочевых путей получила гораздо меньше внимания. Чтобы углубить наше understandiнг врожденных иммунных реакций в мочевых путях во время инфекции с уропатогенных кишечной палочки (УПЭК), мы разработали анализ в пробирке, transuroepithelial миграции нейтрофилов анализ, который позволяет исследовать полиморфноядерных лейкоцитов (ПМН; нейтрофилов) движение через эпителия мочевого пузыря барьер 6 -8. Как и с другими двухкамерных моделей трансэпителиальной миграции, культивированные эпителиальных клеток мочевого пузыря человека выращивают на нижней стороне проницаемой поддержки и образуют сливные эпителиальных слоев. Нейтрофилы человека, выделенные из венозной крови, применяются к базолатеральной стороне эпителиального пласта и миграции через эпителий в физиологически соответствующего базолатеральной к апикальной-направлении количественно в ответ на инфицирование различных штаммов Е. палочки или присутствие хемоаттрактант молекул. Многие исследования были сосредоточены на движения нейтрофилов, как хемокинез и хемотаксис, в отсутствие дополнительных типов клеток. Transuroepithelial миграции нейтрофилов анализ является предпочтительным, поскольку он учитывает сложные взаимодействия между эпителиальных клеток мочевого пузыря и иммунных клеток во время инфекции. Это послушный модель в пробирке имеет потенциал, чтобы разрешить детальное исследование иммунного ответа на uroepithelial поверхностей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Использование культурный клеточной линии эпителиальной мочевого пузыря и Свежевыделенные человека ПМН, мы создали модель в пробирке transuroepithelial миграции нейтрофилов. Эта модель сыграла важную роль в начинают препарировать сложности врожденного иммунного ответа во время инфекци?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальными Институтами Здоровья (NIH) предоставляет R01-DK080752 и P50-DK064540. Мы благодарим J. Loughman за ее усилия в создании этого анализа.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Transwell Inserts (i.e. permeable supports) | Corning | 3472 | 6.5 mm, 3 μm pore, polyester membrane insert |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes | Becton, Dickinson and Company (BD) | 366480 | 16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin |
| BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set | Becton, Dickinson and Company (BD) | 367281 | 21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing |
| BD Vacutainer one-use, nonstackable holder | Becton, Dickinson and Company (BD) | 364815 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | From Leuconostoc mesenteroides |
| Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Ultra-Low Attachment Plates | Corning | 3473 | 24-well, clear flat bottom |
| N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) | Sigma-Aldrich | F3506 | Reconstituted in DMSO to 10 mM |
| Recombinant Human CXCL8/IL-8 | R&D Systems | 208-IL | Reconstituted in PBS to 100 μg/ml |
References
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Zigmond, S. H. Orientation chamber in chemotaxis. Methods Enzymol. 162, 65-72 (1988).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J. Cell Sci. 99 (Pt. 4), 769-775 (1991).
- Chin, A. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury. Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).
- Zemans, R. L., Colgan, S. P., Downey, G. P. Transepithelial migration of neutrophils: mechanisms and implications for acute lung injury. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 40, 519-535 (2009).
- Loughman, J. A., Hunstad, D. A. Attenuation of human neutrophil migration and function by uropathogenic bacteria. Microbes Infect. 13, 555-565 (2011).
- Lau, M. E., Loughman, J. A., Hunstad, D. A. YbcL of uropathogenic Escherichia coli suppresses transepithelial neutrophil migration. Infect. Immun. 80, 4123-4132 (2012).
- Loughman, J. A., Hunstad, D. A. Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase by uropathogenic bacteria attenuates innate responses to epithelial infection. J. Infect. Dis. 205, 1830-1839 (2012).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nat. Rev. Urol. 7, 653-660 (1038).
- Haraoka, M., et al. Neutrophil recruitment and resistance to urinary tract infection. J. Infect. Dis. 180, 1220-1229 (1999).
- Billips, B. K., et al. Modulation of host innate immune response in the bladder by uropathogenic Escherichia coli. Infect. Immun. 75, 5353-5360 (2007).
- Bozeman, P. M., Learn, D. B., Thomas, E. L. Assay of the human leukocyte enzymes myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. J. Immunol. Methods. 126, 125-133 (1990).
- Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. In vitro neutrophil transepithelial migration. Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).
- Säve, S., Mohlin, C., Vumma, R., Persson, K. Activation of adenosine A2A receptors inhibits neutrophil transuroepithelial migration. Infect. Immun. 79, 3431-3437 (2011).
- Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism. Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nat. Protoc. 4, 1230-1243 (2009).
