Bir kültür Mesane EPİTELİ karşısında İnsan Nötrofil Göç Kantitatif Değerlendirilmesi
Summary
Biz üropatojenik Escherichia coli ile mesane enfeksiyonu sırasında akut inflamatuar yanıtın önemli bir bileşeni taklit eden bir in vitro modeli geliştirmiştir. Transuroepithelial nötrofil göçü deneyi, bakteriyel bir enfeksiyon ya da kemo-çekici maddelere cevap olarak, geçirgen destekler üzerinde kültürlenmiştir, mesane epiteli üzerinde insan nötrofil göçü kantitatif bir değerlendirmesini sağlar.
Abstract
Enflamasyon siteye periferiden bağışıklık hücrelerinin işe herhangi mukozal yüzeyde doğal immün yanıtta önemli bir adımdır. Mesane enfeksiyonu sırasında, polimorfonükleer lökosit (PMN, nötrofiller) kan göç ve mesane epitel dolaşırlar. Nötrofilik yanıt yokluğunda enfeksiyonu gidermek için başarısızlık mesane savunma PMN önemini göstermektedir. Kesesi epitelinin üropatojenik Escherichia coli (UPEC) kolonizasyonunu kolaylaştırmak için, idrar yolu enfeksiyonları (İYE) çoğunluğunun neden olan madde, kısmen tanımlanan çeşitli mekanizmalar kullanılarak akut bir enflamatuar yanıtı ıslatın. Bundan başka ev sahibi ve bakteriyel patojen arasındaki etkileşimi incelemek için, UPEC için tabii immun cevabın bu yönünün bir in vitro modeli geliştirmiştir. Transuroepithelial nötrofil göçü deneyinde, Boyden odasının bir varyasyon, kültürlü mesane epithElial hücreler, geçirgen desteğin alt akmak üzere yetiştirilmektedirler. PMN İnsan toplardamar kanından izole edilir ve mesane epitel hücre katmanlarının bazolateral tarafına uygulanır. Bakteriyel bir enfeksiyon ya da kemo-çekici moleküllere yanıt olarak, fizyolojik olarak ilgili bazolateral-apikal yönü temsil eden PMN geçişi, bir hemositometre kullanılarak numaralandırılmış. Bu model UPEC ve ökaryotik hücreler arası etkileşimleri incelemek için hem de PMN mesane epitel geçişi için moleküler şartları sorgulamak için kullanılabilir. Transuroepithelial nötrofil göçü modeli mesane UPEC için başlangıçtaki inflamatuar cevabın anlayışımızı ilerletmek olacaktır.
Introduction
Vücuttaki hücrelerin hareketi, çoğunlukla uzun mesafeler boyunca, büyüme ve gelişmesi, yara iyileşmesi ve bağışıklık tepkisi için gereklidir. Hücre göç karmaşık ve sinyal iletim ve sitoskeletal bileşenlerinin yeniden düzenlenmesi de dahil olmak üzere birçok farklı süreçlerin koordinasyonunu gerektirir. Hücreler tanımlanmış kimyasal geçişlerini (kemotaksı) doğru rastgele (kemokinezinin) hareket olarak yapabilirsiniz. Birçok teknik in vitro hücre göçü incelemek için geliştirilmiştir. En eski ve en yaygın teknik, Boyden haznesi, bir kemo-çekici maddenin alt bölmeye ve ilgi hücrelerinde yerleştirilen dikey iki odacıklı sistem oluşur, üst bölmede 1 yerleştirilir. Iki bölmeyi ayıran tanımlanan boyutta gözenekleri olan geçirgen filtre boyunca hücrelerin hareketi izlenir. Ek teknikler arasında Zigmond odası 2 ve Dunn odası da dahil olmak üzere, hücre göçü araştırmak için geliştirilmiştir3. Bu toplu yaklaşımlar çok farklı hücre tiplerinin hareketine önemli bakış açısı vermiştir.
Kemokinezinin ve kemotaksi temel ilkelerini sorgulama ek olarak, iki odacık tahlilleri hücre dışı matris bileşenleri ve hem de endotelyal ve epitel hücre katmanları üzerinden hücre göçü soruşturma kolaylaştırmıştır. Diğer teknikler üzerinden iki oda sistemlerinin kullanılmasının bir avantajı, gözenekli membranı, kolajen ya da fibrinojen gibi proteinler ile kaplanabilir, ve hücre dışı matris-benzeri bariyer boyunca hücre göçü değerlendirilebilir olmasıdır. Buna ek olarak, kültürlenmiş hücre soyları yetiştirildi ve geçirgen destekler üzerinde farklı olabilir. Endotelyal hücre engeli boyunca hareketini araştırmak için, kültürlenmiş endotelyal hücreleri, geçirgen desteğin üst haznesinde tohumlanır ve büyütülür. Gibi bağışıklık hücreleri gibi hareketli hücreler, en karşısındaki alt rezervuara üst hazne ve göç eklenirfizyolojik apikal-to-bazolateral yönünde endotel bariyer görülmektedir. Bu model kan akışı bağışıklık hücrelerinin ekstravazasyonunu anlamada çok değerli olmuştur. Göç endotel aksine, bir epitel bariyerinden hücrelerinin hareketi tipik olarak bazolateral-apikal yönünde meydana gelir. In vitro olarak, bu etkinlik modellemek amacıyla, araştırmacılar, tohum ve geçirgen desteklerin alt kültürlenmiş epitelyum hücreleri büyür. Hareketli hücrelerin bazolateral-apikal yönü temsil eden epitelyal bariyer boyunca üst hazne ve göç, ilave edilir, izlenir. Transepitelyal göç tür modeller belirgin mukozal yüzeylerinde inflamatuar yanıtlar, özellikle akciğer olanlar ve 4,5 gut anlayışımıza katkıda bulunmuştur.
Bunun aksine, idrar yolu epitel boyunca bağışıklık hücresi ticareti daha az dikkat çekmiştir. Bizim understandi ilerletmek içinbir mesane epitelyal bariyer 6 boyunca hareket, (nötrofil PMN) ng üropatojenik Escherichia coli (UPEC) ile enfeksiyon sırasında idrar yollarında doğuştan gelen bağışıklık tepkilerinin nedeniyle, polimorfonükleer lökosit, inceleme sağlayan bir in vitro tahlil, transuroepithelial nötrofil göçü deneyi geliştirilmiştir -8. Transepitelyal göç diğer iki odacıklı modellerinde olduğu gibi, kültürlenmiş insan mesane epitel hücreleri, geçirgen desteğin alt büyüdü ve birleşik epitel tabakalar oluştururlar. Toplardamar kanından izole İnsan nötrofilleri, epitel tabakanın bazolateral tarafına uygulanır ve fizyolojik olarak ilgili bazolateral-apikal yönünde epitel boyunca göç E farklı suşları ile enfeksiyona yanıt olarak ölçülür E. coli ya da kemo-çekici moleküllerinin varlığı. Pek çok araştırma ek hücre tiplerinin yokluğunda, nötrofil hareketi kemokinezinin ve kemotaksis hem odaklı vardı. Bu hesaba enfeksiyon sırasında mesane epitel hücreleri ve bağışıklık hücreleri arasındaki karmaşık etkileşimler alır gibi transuroepithelial nötrofil göçü deneyi avantajlıdır. Bu uysal in vitro model epitelyal yüzeylerde bağışıklık tepkilerinin ayrıntılı bir araştırma izin vermek için potansiyele sahiptir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kültürlü bir mesane epitel hücre çizgisi ve yeni izole edilmiş insan PMN kullanarak, transuroepithelial nötrofil göçü bir in vitro bir model oluşturduk. Bu model idrar yolu enfeksiyonu (İYE) sırasında doğal immün yanıt, tipik UPEC 9 nedeniyle son derece yaygın bir bakteriyel enfeksiyon karmaşıklığı incelemek başlayan vesile olmuştur. Mesane ya da sistit enfeksiyon esnasında, mesane lümenine PMN işe bakteri açıklık 10 için gereklidir. Bir enflamatuar yanıtı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Sağlık (NIH) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen R01-DK080752 ve P50-DK064540 verir. Biz bu tahlili kurarak onun çabaları J. Loughman teşekkür ederim.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Transwell Inserts (i.e. permeable supports) | Corning | 3472 | 6.5 mm, 3 μm pore, polyester membrane insert |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes | Becton, Dickinson and Company (BD) | 366480 | 16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin |
| BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set | Becton, Dickinson and Company (BD) | 367281 | 21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing |
| BD Vacutainer one-use, nonstackable holder | Becton, Dickinson and Company (BD) | 364815 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | From Leuconostoc mesenteroides |
| Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Ultra-Low Attachment Plates | Corning | 3473 | 24-well, clear flat bottom |
| N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) | Sigma-Aldrich | F3506 | Reconstituted in DMSO to 10 mM |
| Recombinant Human CXCL8/IL-8 | R&D Systems | 208-IL | Reconstituted in PBS to 100 μg/ml |
References
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Zigmond, S. H. Orientation chamber in chemotaxis. Methods Enzymol. 162, 65-72 (1988).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J. Cell Sci. 99 (Pt. 4), 769-775 (1991).
- Chin, A. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury. Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).
- Zemans, R. L., Colgan, S. P., Downey, G. P. Transepithelial migration of neutrophils: mechanisms and implications for acute lung injury. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 40, 519-535 (2009).
- Loughman, J. A., Hunstad, D. A. Attenuation of human neutrophil migration and function by uropathogenic bacteria. Microbes Infect. 13, 555-565 (2011).
- Lau, M. E., Loughman, J. A., Hunstad, D. A. YbcL of uropathogenic Escherichia coli suppresses transepithelial neutrophil migration. Infect. Immun. 80, 4123-4132 (2012).
- Loughman, J. A., Hunstad, D. A. Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase by uropathogenic bacteria attenuates innate responses to epithelial infection. J. Infect. Dis. 205, 1830-1839 (2012).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nat. Rev. Urol. 7, 653-660 (1038).
- Haraoka, M., et al. Neutrophil recruitment and resistance to urinary tract infection. J. Infect. Dis. 180, 1220-1229 (1999).
- Billips, B. K., et al. Modulation of host innate immune response in the bladder by uropathogenic Escherichia coli. Infect. Immun. 75, 5353-5360 (2007).
- Bozeman, P. M., Learn, D. B., Thomas, E. L. Assay of the human leukocyte enzymes myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. J. Immunol. Methods. 126, 125-133 (1990).
- Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. In vitro neutrophil transepithelial migration. Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).
- Säve, S., Mohlin, C., Vumma, R., Persson, K. Activation of adenosine A2A receptors inhibits neutrophil transuroepithelial migration. Infect. Immun. 79, 3431-3437 (2011).
- Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism. Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nat. Protoc. 4, 1230-1243 (2009).
