機能の研究、相互作用、および翻訳後修飾のため出芽酵母タンパク質の抽出と精製
Summary
高品質の酵母細胞抽出物の調製は、個々のタンパク質または全体プロテオームの解析に必要な最初のステップである。ここでは、タンパク質機能、相互作用、および翻訳後修飾を維持するために最適化された出芽酵母細胞のための、高速で効率的、かつ信頼性の高い均質化プロトコルが記載されている。
Abstract
ビーズ打つことによって均質化は、悪名高い混乱させるのは難しいです出芽酵母の細胞からDNA、RNA、タンパク質、代謝物を解放するために、高速かつ効率的な方法です。ここでは、機能的相互作用およびタンパク質の翻訳後修飾を維持するために最適化されたバッファーにタンパク質を抽出するためのビーズミル、ホモジナイザーの使用を記載している。目的のタンパク質を発現する対数的に増殖している細胞は、選択した液体増殖培地で増殖させる。増殖培地は、誘導性プロモーター（ 例えば、ガラクトース）からのタンパク質発現を誘導するための試薬 を補充することができる（ 例えば 、ノコダゾール）の細胞周期段階を同期させる、または（ 例えば、MG132）プロテアソーム機能を阻害する。次に細胞をペレット化し、プロテアーゼおよび/またはホスファターゼ阻害剤を含有する適当な緩衝液中に再懸濁しており、すぐに処理されるか、後で使用するために液体窒素中で凍結される。均質化は20秒BEAの6サイクルによって達成されるD-鼓動（5.5メートル/秒）、氷上で1分間インキュベートした各。得られたホモジネートを遠心分離によってクリアされ、小さな微粒子を濾過により除去することができる。結果クリア全細胞抽出物（WCE）はウェスタンブロッティング続いSDS-PAGEによる全タンパク質の直接分析のためにTCA 20％を使用して沈殿させる。抽出物はまた、特定のタンパク質のアフィニティー精製、翻訳後修飾、または共精製タンパク質の分析の検出に適している。ほとんどのタンパク質精製プロトコルの場合と同様に、いくつかの酵素やタンパク質は、それらの精製および他のためのユニークな条件やバッファー組成物が記載された条件の下で不安定になったり、不溶性のかもしれませんが必要な場合があります。後者の場合、提示プロトコルは、経験的にタンパク質抽出および精製のための最良のビード打ち戦略を決定するために有用な出発点を提供することができる。私たちは、エピトープタグSUMO E3リガーゼ、SIZ1、細胞周期の抽出と精製を示すSlx5、SUMO化およびリン酸化と同様、SUMO-ターゲットユビキチンリガーゼのサブユニットの両方になるタンパク質を規制。
Introduction
酵母遺伝学の素晴らしいパワーは伝説ですが、出芽酵母、 サッカロマイセス·セレビシエ、から天然タンパク質の調製及び分析は、多くの場合、問題をはらんでいます。後者は、酵母細胞壁1のかなりの機械的強度及び弾性のためである。別の手段は、酵素的、化学的、機械的、圧力ベースの全細胞タンパク質抽出物2-6を得るために、酵母細胞の破壊のために記載されている。これらの技術は、その後の分析または精製工程に使用することができる細胞代表、天然のタンパク質抽出物を得るためにそれらの効力が大きく異なる。例えば、酵母細胞壁溶解酵素（ 例えばザイモリアーゼ）、得フェロブラストで除去することができるが、剪断、界面活性剤、またはタンパク質を放出する浸透溶解によって破壊することができる。このアプローチは成功し、多くの細胞下分画するための出発点として使用されるが、それは長いインキュベーションを必要とされていますそれはいくつかのタンパク質7の安定性と互換性がありません。
酵母細胞のタンパク質の化学的抽出のための独自の酵母溶解試薬 （例えば、界面活性剤など）、市販されているが、これらのタンパク質抽出における試薬およびタンパク質のその後の生化学的特徴付けに対する効果の有効性は必ずしも明らかではない8。高圧ホモジナイザーは、しばしばフランス語押下と呼ばれる、効果的に第1高圧にそれらを施し、次いで圧力セル内の小さな開口部を介してそれらを押し出すことによって酵母細胞を破壊する。この技術は、高品質の抽出物を生成したが装置は非常に高価であり、細胞または複数のサンプル9少量のに適しているわけではない。したがって、ビーズミルで酵母細胞の機械的破壊は、しばしば、天然の酵母タンパク質調製物10を選択する方法である。この技術は、酸のWAを有する酵母細胞壁の機械的破壊を伴うシェーカー、vortexersまたはビーズミルの様々行うことができるガラスビーズを流した。特に、この方法は、同時に複数のより小さな試料（1 mlの細胞以下）を処理するために使用することができる。さまざまなビーズやビーズミル混乱行列は今や2 mlのチューブに細胞型のほとんどすべての種類を妨害するために市販されている。他の技術と設備を考慮し、ビーズミル、プロテアーゼおよび/またはプロテアソーム阻害剤と適切なバッファが利用される場合は特に、例えばSUMO化などの翻訳後修飾を維持するのに役立ち、これ酵母細胞の破壊は非常に速く起こるという利点を有しているそして抽出物の温度が制御される。
このプロトコルは、内因性および過剰発現タンパク質の機能を維持するために究極の目標と穏やかな条件の下でタンパク質相互作用、および翻訳後修飾の、高速で効果的、かつ信頼性の高い抽出に焦点を当てています。増殖培地、細胞溶解バッファー組成物、及びビーズミルの設定は、タンパク質間相互作用、例えばSUMO化とユビキチン化などの翻訳後修飾を維持するために最適化される。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、無傷の、ネイティブの準備に焦点を当て、翻訳後のダウンストリームアプリケーションのため出芽酵母細胞からタンパク質を変更しました。このプロトコルを試みる前に、目的のタンパク質を容易に変性条件下12で調製したタンパク質抽出物中で検出することができるかどうかを判断することが重要である。ポリクローナル抗体が利用できない場合、それは、融合…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は彼らのサポートのためにカーシャーラボのすべてのメンバーに感謝します。私たちは、酵母株MHY3765用マークHochstrasserに感謝します。この作品は、NSFの助成金1051970（OK）に、ハワードヒューズ医学研究所学部旅行助成とモンロー学者プログラムグラント（ESへ）によってサポートされていました。
Materials
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | |
| Yeast ORF strain in BG1805 | ThermoScientific | YSC3869 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction |
| pYES2.1 TOPO vector | Life Technologies | K4150-01 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1860932 | |
| 2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap | BioExpress | C-3369-3 | Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8161 | Use for additional filtering of clarified lysate |
| TALON Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | For the purification of 6xHIS tagged proteins |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Life Technologies | NP0321BOX | Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting |
| Simply Blue | Life Technologies | #LC6060 | Protein gel stain |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | Alternative commercial lysis buffer |
| Anti-V5 agarose | Sigma | A7345 | Method of immunoprecipitation |
| ECL | Millipore | WBKL S0 050 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| BIS-TRIS gels | Life Technologies | NP0321BOX | |
| anti-myc antibody | Covance | mms-150R | |
| secondary antibody | Abcam | ab97040 | Goat pAb to mouse IgG (HRP) |
References
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