Fonksiyon Çalışma, Etkileşimler, ve Post-translasyonel değişiklikler için tomurcuklanan Maya Protein Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması
Summary
Yüksek kaliteli maya hücre ekstrelerinin hazırlanması bireysel proteinler veya tüm proteomlarda analizinde gerekli bir ilk adımdır. Burada protein fonksiyonları, etkileşimleri ve translasyon sonrası modifikasyonlar korumak için optimize edilmiştir tomurcuklanan maya hücreleri için, hızlı, verimli ve güvenilir homojenizasyon protokol açıklar.
Abstract
Boncuk dayak ile homojenizasyon bozmaya herkesin bildiği zor tomurcuklanan maya hücreleri, DNA, RNA, protein, ve metabolitleri serbest bırakmak için hızlı ve etkili bir yoldur. Burada, işlevleri, etkileşimleri ve proteinlerinin post-translasyonel modifikasyonlar korumak için optimize tamponlar içine proteinlerin çıkarılması için bir boncuk değirmeni homojenizatör kullanımını tarif eder. Ilgilenilen proteini ifade logaritmik büyüyen hücreler tercih edilen bir sıvı büyüme ortamında yetiştirilir. Büyüme ortamı uyarılabilir promotörler (örneğin, galaktoz), protein ekspresyonunu başlatmak için tepkin maddeler ile takviye edilebilir, (örneğin, Nokodazol) hücre döngüsü aşaması senkronize ya da (örneğin, MG132) proteazom fonksiyonunu inhibe eder. Hücreler daha sonra, topak haline getirilir ve proteaz ve / veya fosfataz inhibitörleri ihtiva eden uygun bir tampon içinde yeniden süspansiyon haline getirildi ve ya hemen işleme ya da daha sonra kullanılmak için likit nitrojende dondurulmuştur. Homojenizasyon 20 sn bea altı döngüleri gerçekleştirilird-dayak (5.5 m / sn), buz üzerinde bir dakika kuluçka takip her. Elde edilen Homojenat santrifüj ile temizlendi ve küçük parçacık süzme ile kaldırılabilir. Elde edilen temizlenmiş tüm hücre ekstresi (WCE) Western lekeleme takiben SDS-PAGE ile toplam proteinlerin doğrudan analiz için% 20 TCA ile çöktürülür. Özütleri aynı zamanda spesifik protein afinite saflaştırma, post-translasyonel modifikasyonlar, ya da ko-temizleme proteinlerin analizi saptanması için uygundur. Çoğu protein arıtma protokolü için olduğu gibi, bazı enzimler ve proteinler, saflaştırma ve diğerleri için benzersiz koşullar ya da tampon bileşimler belirtilen koşullar altında kararsız veya çözünmez olabilir gerektirebilir. İkinci durumda, sunulan protokol deneysel olarak protein çıkarma ve arıtma için en iyi boncuk-dayak strateji belirlemek için yararlı bir başlangıç noktası sağlayabilir. Biz epitop-etiketli SUMO E3 ligaz, Siz1, bir hücre döngüsü çıkarılması ve saflaştırma göstermekSlx5, sumoylated ve fosforile edilmiş, hem de bir SUMO hedefli bir ubikuitin ligaz alt birimi de olur proteini düzenlenir.
Introduction
Maya genetik üstün gücünü efsanedir, ama tomurcuklanan maya, Saccharomyces cerevisiae, gelen yerli proteinlerin hazırlanması ve analiz genellikle sorunlarla doludur. İkinci önemli bir mekanik dayanımı ve maya hücre duvarı 1 elastisite kaynaklanmaktadır. Farklı vasıtasıyla enzimatik ve kimyasal, mekanik ve basınç tabanlı bütün hücre protein ekstresi 2-6 elde etmek için maya hücrelerinin bozulması için tarif edilmiştir. Bu teknikler, daha sonraki analizler ve arıtma aşamalarında kullanılabilir hücre Örnek, doğal protein özleri elde etmek için bu etkinliği açısından büyük farklılıklar gösterir. Örneğin, maya hücre duvarı litik enzimler (örneğin zymolyase) ve ortaya çıkan spheroblasts ile temizlenebilir makaslama, deterjanlar ya da protein serbest bırakmak için osmotik lizis ile bozulabilmektedir. Bu yaklaşım başarılı birçok hücre içi fraksiyonlar için başlangıç noktası olarak istihdam ama uzun inkubasyon gerektirir edilmiştirbazı proteinlerin 7 istikrarı ile uyumlu değildir.
Maya hücreleri proteinlerin kimyasal çıkarılması için tescilli maya lizis reaktifler (deterjanlar gibi), ticari olarak mevcuttur, ancak bu protein ekstraksiyon reaktifleri ve proteinlerin sonraki biyokimyasal karakterizasyonu üzerindeki etkisinin etkinliğini her 8 açık değildir. Genellikle Fransız presler olarak adlandırılan yüksek basınç homojenizatör, etkili ilk yüksek basınç onlara tabi ve daha sonra bir basınç hücre küçük bir açıklıktan onları ekstrüzyon tarafından maya hücreleri kırmak. Bu teknik, yüksek kaliteli özler üretir ama ekipman çok pahalı ve hücreleri veya birden fazla numune 9 küçük miktarlarda için uygun olmayabilir. Bu nedenle, bir boncuk değirmeni içinde maya hücrelerinin mekanik bozulması genellikle yerli maya protein preparatları 10 için tercih edilen bir yöntemdir. Bu teknik, asit-wa ile maya hücre duvarının mekanik bozulması içerirShakers, vortexers veya boncuk fabrikaları çeşitli yapılabilir cam boncuk, döken. Özellikle, bu yöntem, aynı zamanda, birden fazla küçük numuneleri (hücre ya da daha az, 1 ml) işlemek için kullanılabilir. Birçok farklı boncuklar ya da boncuk değirmeni bozulması matris hemen 2 ml tüpler içinde hücre tipi, hemen hemen her türlü bozmak için ticari olarak temin edilebilir. Diğer teknikler ve donanım göz önüne alındığında, bir boncuk değirmeni proteaz ve / veya proteazom inhibitörleri ile, uygun tamponlar kullanılmaktadır, özellikle maya hücrelerinin bozulması gibi sumoilasyon gibi post-translasyonel modifikasyonlar korumaya yardımcı olan, çok hızlı oluşur avantajına sahiptir ve özleri sıcaklığı kontrol edilir.
Bu protokol protein fonksiyonu, etkileşimleri ve translasyon sonrası modifikasyonlar korumak için nihai hedefi ile yumuşak koşullarda endojen ve aşırı dile getirilen proteinlerin, hızlı, etkili ve güvenilir çıkarma odaklanır. Büyüme ortamı, hücre parçalama tamponukompozisyonlar, ve boncuk değirmen ayarları protein etkileşimleri ve bu sumoilasyon ve ubiquitylation gibi translasyon sonrası modifikasyonlar korumak için optimize edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol sağlam, yerli hazırlanması odaklanır, ve post-translationally aşağı akım uygulamaları için tomurcuklanan maya hücrelerinden protein değiştirilmiş. Bu protokol başlamadan önce, ilgi protein kolayca koşullar 12 denatüre hazırlanan protein özleri tespit edilebilir olmadığını belirlemek için önemlidir. Poliklonal antikorlar, mevcut değil ise bu füzyon proteininin Western lekeleri üzerinde tespit edilebilir, böylece etiket ilgi protein epitopa avantajlı olabilir. Bu proto…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz onların destek için Kerscher laboratuar tüm üyeleri teşekkür ederiz. Biz maya suşu MHY3765 Mark Hochstrasser teşekkür ederim. Bu çalışma, NSF hibe 1051970 (OK) ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü Lisans Seyahat hibe ve Monroe Alimler Programı Hibe (ES) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | |
| Yeast ORF strain in BG1805 | ThermoScientific | YSC3869 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction |
| pYES2.1 TOPO vector | Life Technologies | K4150-01 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1860932 | |
| 2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap | BioExpress | C-3369-3 | Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8161 | Use for additional filtering of clarified lysate |
| TALON Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | For the purification of 6xHIS tagged proteins |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Life Technologies | NP0321BOX | Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting |
| Simply Blue | Life Technologies | #LC6060 | Protein gel stain |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | Alternative commercial lysis buffer |
| Anti-V5 agarose | Sigma | A7345 | Method of immunoprecipitation |
| ECL | Millipore | WBKL S0 050 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| BIS-TRIS gels | Life Technologies | NP0321BOX | |
| anti-myc antibody | Covance | mms-150R | |
| secondary antibody | Abcam | ab97040 | Goat pAb to mouse IgG (HRP) |
References
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae. Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).
- Gelperin, D. M., White, M. A., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).
- Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein. J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).
- Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Hannich, J. T., Lewis, A., et al. Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).
- Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).
- Daum, G. G., Böhni, P. C. P., Schatz, G. G. Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria. J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).
- Deutscher, M. P. . Guide to protein purification. , (1990).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid. EMBO J. 7 (7), 2233 (1988).
- Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion. Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).
- Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway. Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).
- Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1. BMC Biol. 9, 74 (2011).
- Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation. J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).
