Billeddannelse af centrosomal proteiner under Drosophila spermatogenesen er en kraftfuld metode til at identificere nye proteiner kritiske for centrosome biologi samt at belyse den særlige funktion af kendte aktører i denne proces.
Centrosomes bevares mikrotubuli-baserede organeller, hvis struktur og funktion ændre sig dramatisk i hele cellecyklus og celledifferentiering. Centrosomes er afgørende for at bestemme celledeling akse under mitosen og nucleate cilier under interfase. Identiteten af de proteiner, der medierer disse dynamiske ændringer er kun delvist kendt, og funktionen af mange af de proteiner, der har været impliceret i disse processer er rudimentære. Nyligt arbejde har vist, at Drosophila spermatogenesen giver et kraftfuldt system til at identificere nye proteiner kritiske for centrosome funktion og dannelse, samt at få indsigt i den særlige funktion af kendte spillere i centrosome-relaterede processer. Drosophila er en etableret genetisk model organisme, hvor mutanter i centrosomal gener kan let opnås let analyseres. Endvidere nylige fremskridt i følsomhed og opløsning lysmikroskopi ogudvikling af robuste genetisk mærkede centrosomal markører har forvandlet evnen til at bruge Drosophila testikler som et enkelt og tilgængeligt modelsystem til at studere centrosomes. Dette papir beskriver brugen af genetisk mærkede centrosomal markører til at udføre genetiske skærme til nye centrosomal mutanter og for at få indsigt i den specifikke funktion af nyligt identificerede gener.
Drosophila testikler er et egnet organ til undersøgelse af en række cellulære og udviklingsmæssige processer og er blevet grundigt undersøgt gennem årene 1-9. Dette håndskrift fokuserer på anvendelsen af Drosophila testikler at studere centrosome, en bevaret cellulær organel. Som i andre systemer, centrosome af Drosophila testikler funktion i mitose, meiose, og ciliogenesis 10. Centrosomes er sammensat af et par mikrotubuli-baserede strukturer kendt som centrioler omgivet af et komplekst protein netværk kaldet pericentriolar materiale (PCM). Den centriole par består af en ældre mor centriole og en yngre datter centriole. Da cellen udvikler sig hen imod mitose begge centrioler adskilt, duplikere, og erhverve en stor mængde PCM til sidst at danne to adskilte centrosomes. Centrosome indeholder den oprindelige mor centriole omtales som moderen centrosome og centrOsome indeholder den oprindelige datter centriole omtales som datter centrosome.
Drosophila testikler er ideelle til at studere den molekylære basis for centrosome biologi ved fluorescensmikroskopi for en række forskellige årsager.
Sammen de ovennævnte karakteristika for Drosophila testikler giver en model, hvor centrosome kan studeres ved let, hurtig og detaljeret billeddannelse. De beskrevne teknikkeri dette papir er blevet anvendt til at undersøge mange aspekter af centrosome biologi, herunder centriole dannelse 11, centriole dobbeltarbejde 15, PCM rekruttering 16 centrosome regulering 17 og ciliogenesis 18. Disse teknikker er også blevet anvendt til at studere centrosome på andre områder af biologien, såsom meiotisk regel 19, spindel samling 20 og centrosome aktivitet i asymmetriske stamceller division 21 blandt mange andre.
Billeddannelse af testikler i centrosome starter med at få fluer, der udtrykker genetisk mærkede centrosomal proteiner og isolere testiklerne fra mandlige larver, pupper eller voksne fluer. Disse fluer er tilgængelige fra flere forskergrupper 1,11,15,22-25. Larve testikler indeholder alle stadier af spermatogenesen før meiosen og er nyttige, når man analyserer mutationer, der er dødelig i puppe eller voksen. Men Late puppe eller ung ADUlt testikler er de mest robuste og indeholder alle præ-og post-meiotiske stadier af spermatogenesen, og dermed gøre dem foretrække til analyse. Da antallet af sædceller falder som fluen aldre, brugen af voksne testiklerne er også velegnet til at studere centrosome i forbindelse med aldring. 26.. En fremgangsmåde af testis isoleret fra voksne fluer er tidligere blevet beskrevet 27.
Billeddannelse af centrosomes og deres funktion i Drosophila testikler kan opnås via tre relaterede spor, der er præsenteret her (figur 3). Udvælgelse af hvilket spor der er mest hensigtsmæssig afhænger af karakteren af det spørgsmål, investigator er adressering.
Spor A indebærer billeddannelse af levende testikler. Det er den mest hurtige af de tre spor, men kan kun anvendes, når prøverne ikke behøver at blive bevaret, og når immunfarvning er ikke påkrævet. I Track A, testikler monteret (intakt, gennemboret eller klippe) på diasog omhyggeligt klemt under et dækglas til at danne et enkelt lag af let identificerbare celler. Cellerne bliver derefter visualiseres ved hjælp af både fase-kontrast mikroskopi og fluorescerende mikroskopi. Brugen af fase-kontrast er særlig vigtig for analysen af Drosophila testikler fordi den afslører cellulære oplysninger, der ikke er synlig med andre former for transmitteret belysning og dermed giver mulighed for hurtig identifikation af forskellige stadier af udviklingen af sæd 28,29. Dog Track A har to primære ulemper. Først er den morfologiske integritet celler ofte kompromitteret når testiklerne er sprængt. For det andet, ikke-fikserede celler undertiden bevæge sig inden prøven, hvilket gør billeddannelse af flere konfokal lag inden for en bestemt region vanskelig. For at fremme analyse af specifikke celletyper, kan testes gennemboret eller skæres for at lede den måde testis brister, således at mase under dækglasset minimalt påvirker morfologien af celletypen af interesse.
Spor B indebærer kemisk fiksering af testiklerne. Dette spor kræver en mellemliggende mængde tid for prøvepræparation og har den fordel, at faste prøver kan gemmes til senere analyse. Desuden fiksering tjener til at gøre cellulære strukturer mere stive, hvilket minimerer bevægelse af prøven under billedbehandling. Dog bliver fase-kontrast mikroskopi langt mindre informative efter kemisk fiksering, gøre nogle stadier af sæd udvikling vanskelige at identificere.
Spor C er den mest tidskrævende, men har den ekstra fordel, at cellulære strukturer er faste og immunofarvet, giver mulighed for visualisering af proteiner, der ikke er tilgængelige med de relevante genetik tags. Der er mange antistoffer til rådighed både kommercielt og fra diverse forskergrupper til immunfarvning centrosomes og centrosome-relaterede strukturer i Drosophila testikler.
Studere centrosome biologi i flyve testikler ved hjælp af genetisk-mærkede centrosomal markører er en nyttig metode til at vurdere centrosome funktion og aktivitet i både en vildtype og mutant kontekst. I særdeleshed, Bane A er velegnet til hurtig screening af centrosomal abnormiteter såsom misdannelse, misegregation, ustabilitet, eller unormal længde i et forsøg på at identificere nye mutanter. Desuden sædcelleantal cilier i levende præparater forbliver motile i ca 15 min efter dissektion og brugen af levende testikler i Track A giver også for spermamotilitet være let løses. Da aktiviteten af sperm motile cilier er direkte relateret til centrosome funktion, kan analyser udføres for at bestemme effekten af forskellige centrosomal mutationer på ciliaere funktion. Spor B kan bruges til mere specifikke bemærkninger, især når de statistiske data, der er nødvendige, såsom til at tælle antallet af centrioler per celle og eller antal celler pr cyste. Spor C er mest useful for detaljerede observationer, der kræver farvning med antistoffer. Eksempler indbefatter mærkning af en bestemt celletype, såsom stamceller, farvning af et protein, der ikke har en tilgængelig tag såsom acetyleret tubulin eller til at kontrollere fravær eller mislocalization af et protein i en mutant.
Når billeddannelse centrosomes og centrosome-relaterede strukturer ved hjælp af genetisk mærkede markører snarere end antistoffer er ikke kun eksperimentelt lettere, men også giver mere robuste og reproducerbare resultater. Derfor er brugen af genetisk mærkede centrosomal proteiner er en pålidelig metode til mekanistiske og kvantitative analyser, der kræver et stort datasæt. For eksempel har brugen af genetisk mærkede centrosomal markører været særligt værdifulde til kvantificering af centriole længde. Sådan analyse har afsløret, at forskellige mutationer kan inddeles i to kategorier baseret på variation i centriole længde. Én kategori omfatter mutationer, change centriole længde, men ikke påvirker standardafvigelsen 1 og den anden kategori omfatter mutationer, der påvirker både centriole længde og standardafvigelsen i længden 11. Sådanne kvantitative data kan give nyttig indsigt i funktionen af bestemte centrosomal gener. Centrosomal mutanter, som udviser defekt centriole længde med en stigning i standardafvigelse kan skyldes en destabilisering af centriolar struktur. Defekt centriole længde med en normal standard fejl, kan dog angive, at mutationen ikke strukturelt destabilisere centriole og er mere tilbøjelige til at være på grund af en ændring i reguleringsmekanisme kontrollerende centriole længde. På grund af uoverensstemmelser i immunofarvning, er det vanskeligt med brugen af antistofmarkørerne alene kvantitative analyser.
Centrosome er en stor, kompleks proteinholdige struktur og mange af dets proteiner findes kun inden for dens indre. Brug genetisk mærkede centrosomalmarkører snarere antistoffer tillader en konsekvent mærke interne komponenter centrosome, hvis epitoper kan være anderledes utilgængelige for antistofmarkørerne. For eksempel localization undersøgelser af Bld10 anvendelse af antistoffer finder protein, der skal beriges ved de distale og proximale ender af centriole 13, mens Bld10-GFP viser en mere ensartet fordeling 1. Men det er også vigtigt at overveje niveauet af ekspression af et særligt genetisk mærkede protein, da dette kan påvirke protein distribution. Lokalisering af Sas-4-GFP og SAS-6-GFP udtrykkes under deres endogene er begrænset til de proximale ender af centriole 1,16,35 På den anden side, Sas-4-GFP og SAS-6-GFP udtrykkes under stærk ubiquitinpromotoren er lokaliseret langs hele længden af centriole 12,14. En anden vigtig overvejelse er virkningen af den genetiske tag på proteinfunktion. Analysere om genetisk mærkede proteiner er funktionelle kan være TESTED ved at indføre de transgene proteiner til en mutant baggrund og undersøge, om de transgene proteiner redder mutantfænotypen.
Fiksering af Drosophila testiklerne kan udføres ved hjælp af en række kemiske fikseringsmidler. Her beskriver vi fiksering med både formaldehyd (spor B) og methanol-acetone (spor C). Dog kan enten fikseringsmiddel anvendes i flæng, og da forskellige fikseringsmidler kemisk kan forstyrre native antistofepitoper, skal valget af den passende fiksativ til immunfarvning bestemmes eksperimentelt. Følgende fikseringsmidler og inkubationsbetingelser er almindeligt anvendt: 3,7% formaldehyd, 5 minutter ved stuetemperatur, methanol, 15 minutter ved -20 ° C acetone i 10 minutter ved -20 ° C, methanol, 15 minutter ved -20 ° C. efterfulgt af acetone, 30 sekunder ved -20 ° C, ethanol, 20 minutter ved -20 ° C. Selvom fiksering med acetone, methanol og ethanol ikke kræver en udvidet permeabilization skridt for immunfarvning, fiksering with formaldehyd bør efterfølges af en 1 times inkubation i PBST-B ved stuetemperatur for at permeabilisere cellemembraner og tillade antistof adgang til intracellulære epitoper. Endvidere er visse fikseringsmidler er mere egnede til bestemte antigener. For eksempel formaldehyd fungerer godt til fiksering af små proteiner, mens methanol og acetone er velegnede til fiksering af store molekylære komplekser 36.
Immunfarvning af Drosophila testiklerne er tidligere blevet beskrevet for at observere chromatin strukturer og mikrotubulus-cytoskelettet 29,37. Her (spor C), er proceduren blevet optimeret til analyse af centrosomal strukturer, der indeholder genetisk mærkede proteiner. Vi giver en detaljeret beskrivelse af denne procedure til at vejlede personer, der er uerfaren i at arbejde i Drosophila testikler. Denne procedure indbefatter også modifikationer til forbedring af bevarelse og morfologien af testiklerne, såsom ved hjælp af siliconized dækglas og positivt ladede glas objektglas.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en bevilling (R01GM098394) fra NIH og National Institute of General Medical Sciences samt tilskud 1.121.176 fra National Science Foundation.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
Positively Charged Slides | AZER Scientific | EMS200A+ | |
Feather Microscalpel | Electron Microscopy Sciences | 72045-30 | |
37% Formaldehyde or Paraformaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Boston Bioproducts | BM-220 | |
18×18 mm coverslips number 1.5 | VWR | 48366 205 | |
Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 ml | |
Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | |
Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T9284-100ML | |
BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
RNAse A | 5 prime | 2900142 | |
Filter paper | Whatman | 1001-055 | |
Glass engraver | Dremel | 290-01 | |
TCS SP5 confocal microscope | Leica | ||
Mounting Media | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
Immuno Stain Moisture Chamber, Black | Electron Microscopy Sciences | 62010-37 | |
Glass Coplin Staining Jar, Screw Cap | Electron Microscopy Sciences | 70315 |