Beeldvorming van centrosomal eiwitten in Drosophila spermatogenese is een krachtige methode om nieuwe eiwitten essentieel voor centrosome biologie identificeren en de specifieke functie van bekende spelers in dit proces verduidelijken.
Centrosomes geconserveerd microtubule organellen basis waarvan de structuur en functie dramatisch veranderen tijdens de celcyclus en celdifferentiatie. Centrosomes zijn essentieel voor de celdeling as bepalen tijdens de mitose en cilia nucleëren tijdens interfase. De identiteit van de eiwitten die deze dynamische mediëren blijft slechts gedeeltelijk bekend en de werking van veel van de eiwitten die zijn betrokken bij deze processen is rudimentair. Recent onderzoek heeft aangetoond dat Drosophila spermatogenese biedt een krachtig systeem om nieuwe eiwitten van cruciaal belang voor centrosome functie en vorming als om inzicht te krijgen in de specifieke functie van de bekende spelers in-centrosome gerelateerde processen te krijgen. Drosophila is een gevestigde genetisch modelorganisme waar mutanten in centrosomal genen kunnen gemakkelijk worden verkregen en gemakkelijk geanalyseerd. Bovendien zouden de recente ontwikkelingen in de gevoeligheid en resolutie van lichtmicroscopie en deontwikkeling van robuuste genetisch gelabeld centrosomal markers hebben de mogelijkheid om Drosophila testes gebruiken als een eenvoudige en toegankelijke modelsysteem om centrosomen studeren getransformeerd. Dit document beschrijft het gebruik van genetisch-gelabeld centrosomal markers om genetische screens uit te voeren voor nieuwe centrosomal mutanten en inzicht in de specifieke functie van nieuw geïdentificeerde genen krijgen.
Drosophila testes een geschikte orgaansysteem een verscheidenheid van cellulaire en ontwikkelingsprocessen te bestuderen en zijn uitgebreid beoordeeld in de jaren 1-9. Dit handschrift oog op de ontwikkeling van Drosophila testes centrosome, een geconserveerd cellulair organel bestuderen. Net als in andere systemen, de centrosome van de Drosophila testes functie in mitose, meiose, en ciliogenese 10. Centrosomes bestaan uit een paar microtubulus gebaseerde structuren bekend als centrioles omgeven door een genoemd pericentriolar materiaal (PCM) complex eiwitnetwerk. De centriole paar bestaat uit een oudere moeder centriole en een jongere dochter centriole. Als de cel vordert richting mitose, zowel centriolen scheiden, dupliceren, en het verwerven van een grote hoeveelheid PCM om uiteindelijk vormen twee verschillende centrosomes. Centrosome met de oorspronkelijke moeder centriole wordt aangeduid als de moeder centrosome en het ceOsome met de oorspronkelijke dochter centriole wordt aangeduid als de dochter centrosome.
Drosophila testes zijn ideaal voor het bestuderen van de moleculaire basis van centrosome biologie door fluorescentiemicroscopie om verschillende redenen.
Samen vormen de hierboven genoemde kenmerken van Drosophila testes biedt een model waarbij de centrosome kan worden bestudeerd door eenvoudig, snelle en gedetailleerde beeldvorming. De beschreven techniekenin dit document zijn toegepast op vele aspecten van het centrosome biologie waaronder centriole vorming 11, centriole dubbel 15, PCM werving 16, centrosome regulering 17 en ciliogenese 18 onderzoeken. Deze technieken zijn ook toegepast op centrosome studie in het gebied van biologie, zoals meiotische regulering 19 spilstelsel 20 en centrosome activiteit in asymmetrische stamcellen celdeling 21 onder vele anderen.
Beeldvorming van testes in de centrosome begint met het verkrijgen van vliegen die genetisch-gelabelde centrosomal eiwitten tot expressie en het isoleren van de testikels van mannelijke larven, poppen of volwassen vliegen. Deze vliegen zijn verkrijgbaar bij verschillende onderzoeksgroepen 1,11,15,22-25. De larvale testes bevatten alle stadia van de spermatogenese voorafgaand aan meiose en zijn nuttig bij het analyseren van mutaties die dodelijk zijn in de pop of volwassene. Echter, Late pupal of jonge adult testes zijn de meest robuuste en bevatten alle pre-en post-meiotische stadia van de spermatogenese, waardoor ze de voorkeur voor analyse maken. Aangezien het aantal zaadcellen af naarmate de vlieg leeftijd, het gebruik van volwassen teelballen is ook geschikt voor het bestuderen centrosome in de context van veroudering. 26. Werkwijze testis isolatie van volwassen vliegen is eerder beschreven 27.
Beeldvorming van centrosomes en hun functie in Drosophila testes kan worden bereikt via drie samenhangende sporen dat hier (figuur 3) worden gepresenteerd. Selectie van welk spoor het meest geschikt is afhankelijk van de aard van de vraag de onderzoeker richt.
Spoor A impliceert beeldvorming van levend testes. Het is de snelste van de drie sporen maar kan alleen worden toegepast wanneer specimens niet te worden bewaard en wanneer immunokleuring is niet vereist. Volg A, zijn testikels gemonteerd (intact, doorboord of gesneden) op dia'sen zorgvuldig onder een dekglaasje geplet tot een enkele laag van gemakkelijk identificeerbare cellen vormen. De cellen worden vervolgens gevisualiseerd middels zowel fase-contrast microscopie en fluorescentie microscopie. Het gebruik van fase-contrast is bijzonder belangrijk voor de analyse van Drosophila testes want het toont cellulaire informatie die niet zichtbaar met andere vormen van uitgezonden verlichting en aldus zorgt voor een snelle bepaling van de verschillende fasen van sperma ontwikkeling 28,29. Echter, Spoor A heeft twee belangrijke nadelen. Eerst wordt de morfologische integriteit van cellen vaak aangetast wanneer de testes zijn gescheurd. Ten tweede, niet gefixeerde cellen soms verplaatsen binnen het model, waardoor de beeldvorming van meerdere confocale lagen binnen een bepaald gebied moeilijk. Om de analyse van specifieke celtypen te bevorderen, kan testes worden doorboord of gesneden om direct de manier waarop de testis breuken zodanig dat pletten onder het dekglaasje minimaal van invloed op de morfologie van het celtype van belang.
Spoor B omvat chemische fixatie van de testes. Deze track vereist een tussenstap hoeveelheid tijd voor prepareren en heeft het voordeel dat vaste exemplaren kunnen worden opgeslagen voor latere analyse. Bovendien fixatie dient om cellulaire structuren stijver te maken, het minimaliseren van beweging van het monster tijdens de beeldvorming. Echter, fase-contrast microscopie wordt veel minder informatief na chemische fixatie, waardoor sommige fasen van sperma ontwikkeling moeilijk te identificeren.
Track C is het meest tijdrovende, maar heeft het voordeel dat de cellulaire structuren vast en immunostained, waardoor de visualisatie van eiwitten die niet beschikbaar zijn met de juiste genetische tags. Er zijn veel antilichamen beschikbaar voor zowel commercieel als vanuit verschillende onderzoeksgroepen voor immunobeeld centrosomes en-centrosome verwante structuren in Drosophila testes.
Bestuderen centrosome biologie in vlieg testes om genetisch gemerkte centrosomal markers is een handige methode voor het beoordelen centrosome functie en activiteit in zowel wild-type en mutant context. Vooral Spoor A is geschikt voor snelle screening van centrosomal afwijkingen zoals misvorming, misegregation, instabiliteit of abnormale lengte in een poging om nieuwe mutanten te identificeren. Bovendien spermatide cilia in levende preparaten blijven beweeglijke ongeveer 15 minuten na dissectie en het gebruik van levende testes Volg A maakt ook sperma motiliteit zij gemakkelijk aangepakt. Aangezien de activiteit van sperma beweeglijk cilia direct gerelateerd aan centrosome functie kunnen assays worden uitgevoerd om de effecten van verschillende mutaties op centrosomal ciliaire functie te bepalen. Spoor B kan voor meer specifieke waarnemingen vooral wanneer statistische gegevens vereist zoals voor het tellen van het aantal centrioles per cel en of het aantal cellen per cyste. Track C is het meest useful voor gedetailleerde observaties die kleuring nodig met antilichamen. Voorbeelden zijn kenmerken van een bepaald celtype zoals stamcellen, kleuring van een eiwit dat geen een beschikbaar tag zoals geacetyleerde tubuline, of de afwezigheid of mislocalization van een eiwit in een mutant verifiëren.
Bij beeldvorming centrosomes en-centrosome gerelateerde structuren, met behulp van genetisch-gelabelde markers dan antilichamen is niet alleen experimenteel eenvoudiger, maar biedt ook meer robuuste en reproduceerbare resultaten. Daarom is het gebruik van genetisch-gelabeld centrosomal eiwitten is een betrouwbare aanpak voor mechanistische en kwantitatieve analyses die een grote dataset nodig. Zo is het gebruik van genetisch gelabeld centrosomal merkers bijzonder waardevol voor de kwantificering van centriole lengte zijn. Een dergelijke analyse heeft aangetoond dat verschillende mutaties kunnen worden ingedeeld in twee categorieën op basis van de variabiliteit in centriole lengte. Een categorie omvat mutaties die change centriole lengte, maar beïnvloeden de standaardafwijking 1 en de andere categorie omvat mutaties die zowel centriole lengte en de standaardafwijking lengte 11 beïnvloeden. Dergelijke kwantitatieve gegevens kunnen nuttig inzicht geven in de functie van bepaalde centrosomal genen. Centrosomal mutanten die defect centriole lengte vertonen een toename in standaard afwijking kan worden veroorzaakt door destabilisatie van centriolar structuur. Echter defect centriole length met een normale standaardfout aan dat de mutatie niet structureel destabiliseren centriole en is waarschijnlijk te wijten aan een verandering in regulatiemechanisme beheersen centriole lengte. Door inconsistenties in immunokleuring, kwantitatieve analyses moeilijk met behulp van antilichaam markers alleen.
Centrosome is een grote, complexe eiwitachtige structuur en veel van de eiwitten zijn alleen te vinden in het interieur. Het gebruik van genetisch-tagged centrosomalmarkers eerder de antilichamen maakt het mogelijk om de interne onderdelen van centrosome waarvan epitopen anders ontoegankelijk antilichaam markers consequent label. Bijvoorbeeld, lokalisatie studies BLD10 gebruik van antilichamen vindt het eiwit worden verrijkt op de distale en proximale einden van de centriole 13, terwijl BLD10-GFP vertoont een meer uniforme verdeling 1. Het is echter ook belangrijk om het niveau van expressie van een bepaald genetisch gemerkt eiwit beschouwen, aangezien dit eiwit verdeling beïnvloeden. Lokalisatie van Sas-4-GFP en SAS-6-GFP expressie onder hun endogene is beperkt tot het proximale uiteinde van de centriole 1,16,35 Anderzijds, Sas-4-GFP en SAS-6-GFP expressie gebracht onder de sterke ubiquitine promoter gelokaliseerd over de gehele lengte van de centriole 12,14. Een andere belangrijke overweging is het effect van de genetische tag op eiwitfunctie. Een analyse of genetisch gemerkte eiwitten zijn functioneel kan tested door de invoering van transgeen eiwit in een mutant achtergrond en onderzoeken of het transgene eiwit redt het mutante fenotype.
Fixatie van Drosophila testes kan worden uitgevoerd met verschillende chemische fixatieven. We beschrijven hier fixatie zowel formaldehyde (spoor B) en methanol-aceton (Track C). Echter, zowel fixatief elkaar gebruikt en aangezien verschillende fixatieven kunnen chemisch verstoren natief antilichaam epitopen, moet de selectie van de geschikte fixatief immunokleuring proefondervindelijk bepaald. De volgende fixatieven en incubatie-omstandigheden worden gebruikt zijn: 3.7% formaldehyde, 5 min bij kamertemperatuur, methanol, 15 minuten bij -20 ° C, aceton, 10 minuten bij -20 ° C, methanol, 15 minuten bij -20 ° C. gevolgd door aceton, 30 seconden bij -20 ° C, ethanol, 20 min bij -20 ° C. Hoewel fixatie met aceton, methanol, ethanol en geen langere permeabilisatie stap voor immunokleuring, fixatie wi vereisene formaldehyde moet worden gevolgd door een 1 uur incubatie in PBST-B bij kamertemperatuur celmembranen doorlaatbaar en laat antilichaam toegang tot intracellulaire epitopen. Bovendien zijn bepaalde fixeermiddelen zijn meer geschikt voor specifieke antigenen. Bijvoorbeeld, formaldehyde functioneert voor bevestiging van kleine eiwitten, terwijl methanol en aceton zijn goed geschikt voor de fixatie van grote moleculaire complexen 36.
Immunokleuring van Drosophila testes is eerder beschreven voor het waarnemen chromatine structuren en de microtubuli cytoskelet 29,37. Here (Track C), is de procedure geoptimaliseerd voor de analyse van centrosomal structuren die genetisch gemerkte eiwitten. Wij bieden een uitgebreide beschrijving van deze procedure aan personen die geen ervaring heeft in Drosophila testes begeleiden. Deze procedure omvat ook wijzigingen in het behoud en de morfologie van de testes, zoals het verbeteren door siliconized coverslips en positief geladen glas microscoop dia's.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door een subsidie (R01GM098394) van NIH en Nationale Instituut van Algemene Medische Wetenschappen evenals subsidie 1.121.176 van National Science Foundation.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
Positively Charged Slides | AZER Scientific | EMS200A+ | |
Feather Microscalpel | Electron Microscopy Sciences | 72045-30 | |
37% Formaldehyde or Paraformaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Boston Bioproducts | BM-220 | |
18×18 mm coverslips number 1.5 | VWR | 48366 205 | |
Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 ml | |
Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | |
Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T9284-100ML | |
BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
RNAse A | 5 prime | 2900142 | |
Filter paper | Whatman | 1001-055 | |
Glass engraver | Dremel | 290-01 | |
TCS SP5 confocal microscope | Leica | ||
Mounting Media | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
Immuno Stain Moisture Chamber, Black | Electron Microscopy Sciences | 62010-37 | |
Glass Coplin Staining Jar, Screw Cap | Electron Microscopy Sciences | 70315 |