A Tissue Culture Modèle tridimensionnel pour étudier primaire moelle osseuse humaine et de ses affections malignes

Summary

Dans les procédés de culture standards cellules sont retirées de leur environnement physiologique et cultivées sur la surface en plastique d'un plat. Pour étudier le comportement de cellules primaires de moelle osseuse humaine, nous avons créé un système de culture en 3-D, où les cellules sont cultivées dans des conditions récapitulant le microenvironnement du tissu natif.

Abstract

La culture de tissus a été un outil précieux pour étudier de nombreux aspects de la fonction de la cellule, du développement normal de la maladie. Les méthodes de culture cellulaire classiques reposent sur la capacité des cellules, soit à attacher à un substrat solide d'une boîte de culture tissulaire ou de croître en suspension dans un milieu liquide. Des lignées de cellules immortelles multiples ont été créées et cultivées à l'aide de telles approches, cependant, ces méthodes ne parviennent souvent lorsque des cellules primaires besoin d'être cultivées ex vivo. Un tel échec a été attribué à l'absence de composants de la matrice extracellulaire appropriées du micro-environnement tissulaire à partir des systèmes classiques où la culture de tissu en plastique est utilisé en tant que surface pour la croissance cellulaire. La matrice extracellulaire est un composant intégral de la micro-environnement tissulaire et sa présence est indispensable pour le maintien des fonctions physiologiques telles que la polarisation des cellules, la survie et la prolifération. Nous présentons ici une méthode de culture des tissus en 3 dimensions où cel os primaire de la moellels sont cultivées dans une matrice extracellulaire formulé pour récapituler le microenvironnement de la moelle humaine (système RBM). Incorporé dans la matrice extracellulaire, les cellules sont alimentées en nutriments à travers le milieu supplémenté avec du plasma humain, fournissant ainsi un système complet où la survie et la prolifération cellulaires peuvent être maintenues pendant jusqu'à 30 jours, tout en maintenant la composition cellulaire du tissu primaire. En utilisant le système FrP nous avons développé avec succès des cellules de moelle osseuse provenant de donneurs normaux primaires et les patients atteints d'amylose, et diverses hémopathies malignes. Le système permet FrP directe pour la visualisation en temps réel, dans la matrice du comportement cellulaire et évaluation de l'efficacité préclinique de nouveaux agents thérapeutiques. De plus, les cellules peuvent être isolées à partir de la GR et ensuite utilisés pour la transplantation in vivo, le tri cellulaire, cytométrie de flux, et de l'acide nucléique et l'analyse des protéines. Pris dans leur ensemble, le procédé FrP fournit un système fiable pour la croissance de l'os primaire Marrow cellules dans des conditions physiologiques.

Introduction

La culture de tissus a été développé pour étudier le comportement des cellules dans un environnement contrôlé pour minimiser la variabilité systémique lorsque l'on compare différents processus dans les organismes intacts. Cette méthode a été créé dans le début des années 1900 et ^1,2 réfère à une technique où explants de tissus ont été cultivées ex vivo dans un plat en verre. Au milieu des années 1900 le système a été adapté pour cultiver des cellules dispersées plutôt que des fragments de tissus intacts, et de la culture de tissus »et de« culture cellulaire »est devenu synonyme de ^3. Dans de tels systèmes de culture de cellules clas....

Protocol

Une. Préparation à l'avance

1. Gardez pipettes sérologiques stériles et embouts de pipette à 4 ° C.
   Dépannage: gels Matrigel à température ambiante (RT); l'aide de pipettes froid et conseils vous empêcher Matrigel de gélification lors de la configuration de la culture.
2. Décongeler une bouteille de Matrigel à 4 ° C pendant la nuit.

2. Préparation des réactifs

1. Préparation de la solution de fibronectine stock: Faire un / ml solution de fibronectine de stock 1 mg par dissolution de 100 mg fibronectine humaine dans 100 ml d'eau distillée. Une fois la fibronectine a dissous, ....

Results

Comme les cellules de moelle osseuse primaires sont incapables de proliférer dans des conditions de culture tissulaire standard, le système RBM a été créé pour imiter étroitement le microenvironnement osseux, en fournissant un système de culture de cellules et d'élargir BM ex vivo. Les principaux composants de la matrice extracellulaire BM, la fibronectine, collagène de type I, le collagène IV, la laminine et ^21, ont été incorporés dans la matrice FrP de fournir l'échafaudage structurel à cette cultu.......

Discussion

Le modèle FrP fournit un système complet où la composition cellulaire de la BM est maintenue ex vivo pendant 30 jours. BM cellules cultivées dans FrP auto-stratifier selon leur fonction imitant de près l'architecture BM trouvé in vivo. En outre, il s'agit du premier système qui permet l'expansion de l'myélome multiple clone ^8. Les étapes les plus critiques pour assurer la croissance robuste des cellules BM et le succès global de la culture sont les suivantes: 1) pour obtenir .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CellTrace CFSE kit de prolifération pour cytométrie en flux	Invitrogen/Life Technologies	C34554
Fibronectine à partir de plasma humain	Millipore	NG1884448
Ficoll-Paque PLUS	GE Lifesciences	17-1440-02
Matrigel matrice de membrane basale	BD Biosciences	354234
Collagène queue de rat type I	BD Biosciences	354249	Collagen I de Millipore ne se polimérise pas correctement en utilisant ce protocole
Milieu de montage VECTASHIELD pour la fluorescence (ensemble régulier)	Vector Laboratories	H-1000
SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX	comprimés Sigma-Aldrich	F4648	Pour la coloration TRAP
SigmaFast BCIP/NBT	comprimés Sigma-Aldrich	B5655	Pour la coloration à la phosphatase alcaline
Microscope confocal Zeiss LSM 510  ;	Logiciel Carl Zeiss
Zeiss 510 Logiciel d’analyse d’images	Carl Zeiss pour l’analyse		confocale
Microscope inversé Zeiss Axiovert 200M  ;	Carl Zeiss
Logiciel MetaMorph	Dispositifs moléculaires Logiciel		d’analyse d’images pour cytomètre en flux Axiovert 200M
FACSort  ;	Logiciel BD Biosciences
CellQuest Pro  ;	BD Biosciences		Logiciel pour l’analyse des données de cytométrie en flux