Isolatie van myeloïde dendritische cellen en epitheelcellen van Human Thymus
Summary
Dit protocol detailleert een methode voor het isoleren van antigen-presenterende cellen uit humane thymus via verschillende stappen enzymatische afbraak van het weefsel, gevolgd door centrifugatie van de enkele celsuspensie en tenslotte magnetische en / of FACS sorteren van celpopulaties plaats.
Abstract
In dit protocol bieden wij een methode om dendritische cellen (DC) en epitheelcellen (TEC) isoleren van de humane thymus. DC en TEC zijn de belangrijkste antigeen presenterende cel (APC) soorten gevonden in een normale thymus en het is bekend dat ze verschillende rollen spelen tijdens de thymus selectie. Deze cellen zijn gelokaliseerd in verschillende micro-omgevingen in de thymus en elke soort APC maakt slechts een kleine populatie van cellen. Om verder inzicht in de biologie van deze celtypen karakterisatie van deze celpopulaties is zeer wenselijk maar door hun lage frequentie, isolatie van een van deze celtypen vereist een efficiënte en reproduceerbare werkwijze. Dit protocol detailleert een methode die geschikt zijn voor karakterisatie van diverse cellulaire eigenschappen te verkrijgen. Thymusweefsel mechanisch verstoord en na verschillende stappen van enzymatische digestie, wordt het resulterende celsuspensie verrijkt met een Percoll dichtheid centrifugatie stap. Voor isolatie van myeloïde DC (CD 11 c <sup> +), cellen van de lage-dichtheid-fractie (LDF) worden immunoselected door magnetische celsortering. Verrijking van TEC populaties (MTES, Ctec) wordt bereikt door depletie van hematopoietische (CD45 hi cellen) van de lage-dichtheid Percoll celfractie waardoor hun verdere isolering via fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) met specifieke cel markers. De geïsoleerde cellen kunnen worden gebruikt voor verschillende stroomafwaartse toepassingen.
Introduction
De thymus is het orgaan waarin T cel ontwikkeling optreedt. De relatieve en absolute omvang afneemt met de leeftijd als het achtereenvolgens wordt vervangen door vet hoewel thymus activiteit nog kan worden gedetecteerd in de ouderdom. Het belang van de immuunrespons aangetoond in de vroege jaren 1960 1.
De T-cel repertoire wordt gevormd door de interactie van T-celreceptoren met peptide-MHC complexen op verschillende soorten thymus APC, die leven of dood cues de ontwikkeling T-cellen, wat resulteert in een functioneel en grotendeels zelfverdraagzaam T cel repertoire 2.
Ongeveer 98% van de cellen in de humane thymus ontwikkelen T genoemd thymocyten cellen. De resterende 2% bestaat uit een aantal verschillende celtypen, waaronder een verscheidenheid van TEC (corticale, medullair, subcapsulaire), myeloïde en plasmacytoïde DC (mDC PDC), macrofagen, B cellen, volwassen re-circulerende T-cellen, granulocyten, fibroblasts, endotheelcellen en zeer zeldzame epitheliale cellen met een expressie fenotype lijkt op die van cellen van andere weefsels zoals spieren, neuronen en respiratoire epitheel (figuur 1). Van deze, TEC en DC zijn de belangrijkste APC soorten gevonden in een normale thymus. In de afgelopen jaren is de zuivering van deze APC types voor cultuur en moleculaire profiel kreeg meer en meer belangstelling. Door hun lage frequentie, isolatie van een van deze celtypen voor gedetailleerde analyse vereist een efficiënt, reproduceerbaar en kosten-effectieve procedure. De hier gepresenteerde methode is een wijziging van eerder gepubliceerde studies 3,4.
Zoals bij andere weefsels, kunnen cellen extractie uit de thymus worden bereikt door enzymatisch opsplitsing van de cel-cel en cel-matrix interacties netwerken, om een suspensie van afzonderlijke cellen te verkrijgen. Er zijn bepaalde parameters, zoals goede dissociatie efficiëntie, celopbrengst, leefbaarheid en behoud van cellen en celurface markers die cruciaal zijn en moeten worden geoptimaliseerd voor de succesvolle isolatie van deze zeldzame celpopulaties.
In dit protocol wordt isolatie van DC en TEC subsets uitgevoerd door een enkele celsuspensie van weefsel door mechanische verbreking en enzymatische digestie. We gebruiken Collagenase Een van Clostridium histolyticum, die een uitgebalanceerde verhouding van verschillende enzym activiteiten heeft, af te breken de inheemse collageen, dat het weefsel bij elkaar houdt. DNase I is in de enzymoplossing naar cel aggregatie te verminderen door vrij DNA van dode cellen (thymocyten zijn zeer gevoelig). We hebben bovendien een alternatieve benadering van de typische enzymatische digestie weefsel met mechanische en enzymatische weefselbehandelelektrode bijgestaan door een weefsel Dissociator. De celsuspensie wordt dan onderworpen aan een Percoll dichtheid centrifugatie voor verrijking van lage dichtheid fractie (LDF) cellen. Van deze fractie van de cellen, kan DC door kleuring f worden geïsoleerdof DC-oppervlaktemerkers (bijvoorbeeld CD 11 c +) en met behulp van magnetische scheiding of fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). In tegenstelling tot de lymfoïde cellen die de meeste cellen in de thymus, hoeft TEC CD45 niet tot expressie op een hoog niveau, maar positief voor de epitheliale cel adhesie molecuul EpCAM. CTEC kunnen worden onderscheiden van medullaire TEC door de expressie van een toch ongedefinieerde antigeen herkend door de CDR-2 (corticale dendritische reticulocyten-2) antilichaam 4,5 en iets lager EpCAM-expressie. De differentiële co-expressie van EpCAM en CDR2 maakt de efficiënte isolatie van deze TEC subsets via high-speed celsortering 6.
De hier gepresenteerde protocol geoptimaliseerd voor menselijke thymus weefsel. De duur van de procedure is gebaseerd op de hoeveelheid weefsel en het vermogen van de experimentator en de snelheid van de cel sorteerder als FACS sortering wordt gebruikt. Normaal gesproken kan het protocol voor de isolatie van DC binnen 5-6 Uur en voor de isolatie van VEG 8-10 uur. De isolatie van DC en TEC subsets van thymusweefsel is tijd gevoelig. Hoe sneller de isolatieprocedure, hoe beter de toestand van de cellen. Tenslotte kunnen de geïsoleerde cellen worden voor verder onderzoek als vergelijkende studies van mRNA en eiwitexpressie PCR experimenten eiwitisolatie, moleculaire profiel (dwz transcriptomics, micro RNA-analyse) en celkweek 6.
Ethiek Verklaring
Om te kunnen werken met menselijke thymus weefsel moet de onderzoeker om goedkeuring te verkrijgen van de lokale ethische commissie of de verantwoordelijke overheden als een geïnformeerde schriftelijke toestemming van de donor (of meestal zijn of haar ouders, omdat weefsel wordt meestal verkregen uit minderjarig kinderen). Bovendien moeten alle menselijke weefsels worden behandeld als potentieel infectieus en passende maatregelen moeten worden genomen, zoals het werken met handschoenen, etc.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven protocol is een modificatie van het protocol gepubliceerd door Gotter c.s. 4. Kritische stappen in het protocol zijn de initiële toestand en voorbereiding van de weefsels alsmede de Percoll dichtheid scheiding. We raden aan het weefsel zo snel mogelijk na verzameling te verwerken. Het is belangrijk om snel maar grondig werken bij het schoonmaken en snijden van het weefsel. Tijdens de thymocyt wassen in stap 2.3 beschreven, is het cruciaal om de juiste balans te vinden bij het uito…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij zijn dankbaar voor de chirurgen van de afdeling Thorax-en Cardiovasculaire Chirurgie, Universiteitskliniek Tübingen voor het verstrekken van ons met de thymus monsters en Bruno Kyewski (DKFZ, Heidelberg, Duitsland) voor het verstrekken van de CDR2 antilichaam. We willen ook graag Hans-Jörg Bühring en Sabrina Grimm bedanken van de sorteerinrichting (Universiteit van Tübingen). Dit werk werd ondersteund door de SFB 685 en de Hertie Foundation.
Materials
| Reagents and Materials | |||
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| Dulbecco's PBS | PAA | H15-002 | |
| Fetal Bovine Serum-Gold | PAA | A15-151 | |
| Bovine Serum Albumin | PAA | K41-001 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | |
| DNase I, grade II bovine pancreatic | Roche | 10 104 159 001 | |
| Trypsin-EDTA 10x in PBS | PAA | L11-001 | stock conc. 20 mg/ml |
| Alexa Fluor 488 Protein Labelling kit | Molecular Probes | A-10235 | |
| anti-human CDR2 (purified) | Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germany | labeled with Alexa Fluor 488 | |
| anti-human CD45 (Pacific Blue) | Biolegend | 304022 | |
| anti-human EpCAM (APC) | Miltenyi Biotec | 130-091-254 | |
| anti-human CD11c (PE) | Miltenyi Biotec | 130-092-411 | |
| anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| anti-CD45 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | for tissue dissociator |
| Percoll (density 1.130 g/ml) | GE Healthcare, Life Sciences | 17-0891-01 | |
| Sterile distilled Water (DNAse/ RNAse free) | GIBCO | 10977-035 | |
| Gamunex 10% | Tajecris-Biotherapeutics | G120052 | 1:10 pre-dilution, use 20 μl/1 x 106cells |
| 0.22 μm filter | Millex GS | SLGS033SS | Syringe driven |
| Stericup filter unit | Millipore | SCGPU05RE | Pump driven |
| 50 ml PC oak ridge centrifuge tubes | Nalgene | 3118-0050 | 50 ml |
| 50 ml PP conical tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| 12 mm x 75 mm 5 ml test tubes | Becton Dickinson | 352058 | FACS stainings |
| Cell strainer 70 μm | Becton Dickinson | 352350 | |
| INSTRUMENTS | |||
| Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu) | Becton Dickinson | ||
| Sorvall Evolution R6 (rotor) | Kendro | ||
| Rotator REAX 2 | Heidolph | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093 235 | tissue dissociator |
References
- Miller, J. F. A. P. The discovery of thymus function and of thymus-derived lymphocytes. Immunological Reviews. 185, 7-14 (2002).
- Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat Rev Immunol. 9, 833-844 (2009).
- Vandenabeele, S., Hochrein, H., Mavaddat, N., Winkel, K., Shortman, K. Human thymus contains 2 distinct dendritic cell populations. Blood. 97, 1733-1741 (2001).
- Gotter, J., Brors, B., Hergenhahn, M., Kyewski, B. Medullary Epithelial Cells of the Human Thymus Express a Highly Diverse Selection of Tissue-specific Genes Colocalized in Chromosomal Clusters. The Journal of Experimental Medicine. 199, 155-166 (2004).
- Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 36, 1511-1517 (1988).
- Stoeckle, C., et al. Cathepsin S dominates autoantigen processing in human thymic dendritic cells. Journal of Autoimmunity. 38, 332-343 (2012).
- Woods Ignatoski, K. M., Bingham, E. L., Frome, L. K., Doherty, G. M. Directed trans-differentiation of thymus cells into parathyroid-like cells without genetic manipulation. Tissue Eng Part C Methods. 17, 1051-1059 (2011).
- Williams, K. M., et al. Single Cell Analysis of Complex Thymus Stromal Cell Populations: Rapid Thymic Epithelia Preparation Characterizes Radiation Injury. Clinical and Translational Science. 2, 279-285 (2009).
- Bendriss-Vermare, N., et al. Human thymus contains IFN-α-producing CD11c-, myeloid CD11c+, and mature interdigitating dendritic cells. The Journal of Clinical Investigation. 107, 835-844 (2001).
- Schmitt, N., et al. Ex vivo characterization of human thymic dendritic cell subsets. Immunobiology. 212, 167-177 (2007).
- Dzionek, A., et al. BDCA-4: Three Markers for Distinct Subsets of Dendritic Cells in Human Peripheral Blood. The Journal of Immunology. 165, 6037-6046 (2000).
- Wu, L., Shortman, K. Heterogeneity of thymic dendritic cells. Seminars in Immunology. 17, 304-312 (2005).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of Immunological Methods. 385, 23-34 (2012).
- Adamopoulou, E., Tenzer, S., Hillen, N., Klug, P., Rota, I. A., Tietz, S., Gebhardt, M., Stevanovic, S., Schild, H., et al. Exploring the MHC-peptide matrix of central tolerance in the human thymus. Nature Communications. , (2013).
