蜡蛾蜡螟的幼虫最近被确立为一种体内模型来研究嗜肺军团菌感染。在这里,我们展示了基本技术, 军团菌的发病特点的幼虫,包括接种,细菌毒力和复制的测量和提取被感染的血细胞和分析。
嗜肺军团菌 ,命名为退伍军人病重症肺炎,病原体是一种重要的人类病原菌,感染和肺泡巨噬细胞内复制。其毒性取决于点/ ICM IV型分泌系统(T4SS),这是必要建立一个复制许可的液泡称为含液泡(LCV)的军团上。L.肺感染可以在小鼠中进行建模然而大多数小鼠品系是不许可的,从而导致了寻找新的感染模型。我们最近表明,蜡蛾蜡螟的幼虫都适合L的调查肺军团菌感染。G。蜡螟被越来越多地用作感染模型的人类病原体和几个菌种毒力之间存在于昆虫和哺乳动物模型很好的相关性。幼虫的免疫防御系统的一个关键组成部分是血细胞,界人巨噬细胞,它占用和破坏的入侵者。L.肺是能够感染,形成一个LCV和这些细胞内复制。在这里,我们展示了用于分析L.协议在G.杆菌毒力蜡螟的模型,其中包括如何成长传染病L。肺 ,预处理与抑制剂的幼虫,感染的幼虫以及如何提取感染细胞进行定量和免疫荧光显微镜。我们还描述如何量化细菌复制和健身竞争分析。这些方法允许突变体的快速筛选,以确定因素L.重要菌毒力,描述一个新的工具来帮助我们这个复杂的病原体的理解。
感染的动物模型中的细菌毒力因子的确定是无价的。然而,无脊椎动物模型已经受到越来越多的关注,一个可行的替代感染哺乳动物的传统模式。蜡蛾幼虫, 大蜡螟越来越多地被用来研究一些重要的人类病原体,包括革兰氏阳性1和革兰氏阴性菌2,3和几种病原真菌4,5。使用昆虫模型具有许多优于传统的哺乳动物模型的优点,如无脊椎动物,G.蜡螟不受哺乳动物模型的道德限制。此外,幼 虫可容易地维持,感染通过注射无麻醉,经过预处理化学抑制剂6和维持培养,在37℃7。有趣的是,在G中几个微生物的致病性之间有良好的相关性MELlonella和感染的哺乳动物模型已经建立2,8。 G的免疫系统的增加的了解蜡螟还协助在这个模型有机体的特征。虽然昆虫没有一个适应性免疫系统在哺乳动物中发现,他们有成熟的细胞和肱骨防御包括生产抗菌肽9。血细胞是细胞防御系统的主要介质,并在G的血淋巴(或血液)中发现的数量最多的细胞类型蜡螟 10,这些细胞是专业的吞噬细胞和由两个占用,并在吞噬溶酶体隔室10,11降解细菌和周围侵入的细菌形成结节,物理限制细菌复制12执行类似的功能,以人类巨噬细胞和嗜中性粒细胞。
嗜肺军团菌是一种呼吸道病原体引起严重pneumoni一个(军团病)的易感人群,如老人或免疫功能低下13。 军团菌在环境和人为的水源,它是不同种类的淡水变形虫14,15的病原体无处不找到。 军团菌生存和通过利用多蛋白复合物被称为点/ ICM(有缺陷的细胞器贩卖/胞内乘法)型4分泌系统(T4SS)易位超过275个效应蛋白进入宿主细胞16-20这些专业的吞噬细胞内复制。这些蛋白质有助于颠覆了正常的宿主细胞吞噬途径,从而创建包含液泡(LCV)的军团菌 。的LCV避免与溶酶体融合,而是招募质网(ER)衍生的小泡,导致一个专门的隔室,类似于粗糙ER 21,22。L.肺军团菌被认为是一种偶然的人类路径OGEN;相同的策略,允许它在变形虫复制,也让人类肺泡巨噬细胞23复制。
哺乳动物宿主已被定性为模型人类军团菌感染,包括小鼠和豚鼠24,25。然而,大多数的小鼠品系有抗药性的军团菌感染26唯一的例外是近交系白化病的A /系小鼠,其中开发一个温和的,自限性感染24。虽然豚鼠模型更类似于人类疾病25,缺乏突变体和增加的成本阻碍了它们的使用27。此外,一些无脊椎动物模型已经被开发用于嗜肺军团菌感染,包括线虫 28, 果蝇变形虫30-32的几个品种29和。然而,这些模型也有弱点,毒力在C。线虫 </em>系统不点/ ICM-28依赖性,限制了该模型的实用性。 果蝇模型已被证明有效的调查细菌的毒力因子29,似乎不过是有前途,这种模式还没有得到充分的特点。单细胞变形虫是L的主机环境肺军团菌 ,是理想的调查致病因素的作用在分子水平上33但是缺乏哺乳动物宿主细胞对感染的反应,如半胱天冬34的几个重要介质。现有模型的弱点,伴随着高成本和有关哺乳动物的实验伦理问题,导致了寻找其他合适的模式生物29,35。
最近,我们证明了G。蜡螟是一个合适的模型,L。肺发病机制36,37。这个协议的细节用于感染实验技术ING G。蜡螟幼虫,幼虫分析道德,提取血细胞计数和免疫荧光和确定了可行的CFU计数的复制从受感染的幼虫。
对大蜡螟的嗜肺军团菌感染的幼虫模型是发病的体内研究的有用工具。这里,示出了一个数字巨噬细胞的感染方面的可以在杠杆被概括蜡螟模型,包括点/ ICM T4BSS的毒力和细菌复制的作用和点/ ICM-效应上实发展的定位。此外,我们证明了肌动蛋白聚合的化学抑制剂显著降低幼虫死亡率,极似在macophages 47得到的结果和支持的证据表明,细菌的内在需要引起幼虫死亡率。先前,这已经证实,L之间的偏差在毒力见于其他感染模型肺军团菌菌株能在G进行验证蜡螟和诱导毒力因子在后期指数生长期所需的细菌的毒力<su对> 36,确认了G。蜡螟是一个合适的模型,L。肺军团菌感染。
确定L的CFU从幼虫杆菌感染它们可以单独或混合感染大大增加了模型的实用性。以前,有几个因素已经发现,在感染29,48-51中的一个或多个模型上细菌复制微妙的影响。虽然幼虫不具备适应性免疫系统,先天免疫反应的存在提供了强的选择相比,单独的巨噬细胞,其可以用于扩增细微的表现型。因此,它是可能的,而这些菌株可能不会显著影响幼虫死亡率,它们可以显示在G.减少细菌复制或健身蜡螟模型。以及L的复制肺中的幼虫,我们已经表明显著血细胞耗竭后期的感染。由于L。肺预计裂解宿主细胞,在其复制周期结束时,测定血细胞耗竭也可作为细菌复制的间接测量。血细胞耗竭之前已与相关感染3,52昆虫死亡,虽然最近的研究结果表明,这张照片是更复杂的比第一belived 37。最近,已经表明,幼虫饥饿通过免疫反应53抑制导致增加对感染的易感性。在这里描述的试验,幼虫不喂了研究的持续时间和它不知道有多好喂养幼虫会到L回应肺军团菌感染。
一个G的优点蜡螟作为模式生物是便于提取感染幼虫血细胞和定量。以前的视频显示各种方法,从昆虫54,55血细胞中提取然而,遇见HOD这里介绍的是简单,适合立即处理。一旦提取,血细胞可轻易量化,用于免疫荧光,透射电子显微镜36或流式细胞仪56或培养和感染的体外 3使细胞对病毒感染的反应进行详细调查。这显著增加了模型的灵活性。有一点需要注意在G免疫荧光蜡螟是抗体的供应有限验证对G。蜡螟的蛋白质。然而,研究证明产生抗体对抗幼虫蛋白57抗体及抗人免疫相关蛋白的发现认识到G。蜡螟蛋白11展示了潜在的免疫荧光测定对G。蜡螟血细胞。
G的方便蜡螟感染可以快速,中等通量筛选,可以用于比较各种军团杆菌物种和菌株的毒力,并可以用于进一步分析先前发现的毒力因子,如粘附分子58或2型分泌系统59,它在其它模型中所需的毒力。此外,使用这种模式将使新型毒力因子包括分泌和转运效应蛋白的鉴定和进一步鉴定。最近,已经表明L的该磷脂酶C活性肺军团菌在G的作用蜡螟的毒力60,而点/ ICM效应蛋白SDHA是必需的毒力37。此外,我们最近表明,有在G中观察到的表型之间的相关性蜡螟和在A /系小鼠品系37。
这表明了这个工具的价值,以配合环境原生动物和单细胞宿主和穆里NE感染模型。在G。蜡螟模型将更加有价值成为今后,一旦幼虫基因组序列将可与多种遗传工具被建立。在这个方向的步骤包括最近出版的详细免疫相关转录组61和主动性,提升基因沉默在鳞翅目属62的形成。
通过使用G。蜡螟幼虫,我们有许多细菌毒力的简单,快速读出,可用于研究L的发病机制肺军团菌 。建立这些分析和L的更广泛的筛查肺军团菌血清型和将增加这个新工具的实用工具,将有助于我们L.的理解肺的发病机制。
The authors have nothing to disclose.
华润哈丁是由威康信托助学金WT086724支持。
Material/ Equipment | |||
ACES yeast extract (AYE) broth | 4 g ACES, 4 g yeast extract, 0.4 g α-ketoglutarate, pH 6.9, 400 ml H2O, autoclaved, 4 ml iron solution*, 4 ml cysteine solution* *add sterile ingredients after autoclaving |
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Charcoal buffered yeast extract (CYE) plates | As above, with the addition of 0.6 g activated charcoal and 6 g agar | ||
Sterile iron solution (Ferric Pyrophosphate) | Sigma | P6526 | 0.6 mM solution, sterile filtered |
Sterile cysteine solution | Sigma | C7880 | 3.3 mM solution, sterile filtered |
G. mellonella (waxworms) | Livefood UK | W250 | |
Anti-HA-Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate (TRITC) | Sigma | H9037 | |
Anti-Legionella LPS | Cambridge Biosciences | PA1-7227 | |
Anti-Rabbit IgG Alexa488 | Jackson Immunoreach | 711-485-152 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma | I6758 | |
Dulbeccos phosphate buffered saline (D-PBS) | Sigma | D8662 | |
Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1026 | |
Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma | A9434 | |
Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | |
Digitonin | Sigma | D141 | |
Cytochalasin D | Biomol International | BML-T109-0001 | |
[header] | |||
Material | |||
Microtiter Syringe | Sigma | 24544 | |
Cell counter, double, Improved Neubauer | VWR | 631-0926 | |
Centrifuge | For centrifuging plates | ||
Fluorescence microscope | Any microscope with appropriate filters for the required fluorophores | ||
Inverted microscope | For viable cell counting | ||
Puncture-proof glove | Turtleskin |