Larven af voks møl Galleria mellonella blev for nylig etableret som en in vivo model for at studere Legionella pneumophila infektion. Her vil vi demonstrere grundlæggende teknikker til at karakterisere patogenesen af legionella i larverne, herunder podning, måling af bakteriel virulens og replikation samt udvinding og analyse af inficerede hæmocytter.
Legionella pneumophila, det agens af en alvorlig lungebetændelse kaldet legionærsyge, er en vigtig menneskelig patogen, som inficerer og replikater inden alveolære makrofager. Dens virulens afhænger af Dot / Icm type IV sekretionssystem (T4SS), som er afgørende for at etablere en replikering eftergivende vakuole kaldet Legionella indeholder vakuole (LCV). L. pneumophila infektion kan modelleres i mus dog de fleste musestammer ikke er eftergivende, hvilket fører til søgen efter nye infektion modeller. Vi har for nylig vist, at larver af voks møl Galleria mellonella er egnede til undersøgelse af L. pneumophila infektion. G. mellonella anvendes i stigende grad som en infektion model for humane patogener og en god korrelation mellem virulens af flere bakteriearter i insekt og pattedyr modeller. Et centralt element i larverne immunforsvar er hæmocytter, erhverval fagocytter, der tager op og ødelægge angriberne. L. pneumophila er i stand til at inficere, danner en LCV-og replikere i disse celler. Her demonstrerer vi protokoller til analyse L. pneumophila virulens i G. mellonella model, herunder hvordan at vokse smitsomme L. pneumophila, forbehandle larverne med inhibitorer, inficere larverne, og hvordan man udtrække inficerede celler til kvantificering og immunofluorescensmikroskopi. Vi beskriver også, hvordan at kvantificere bakteriel replikation og fitness i konkurrencesager assays. Disse metoder giver mulighed for hurtig screening af mutanter for at bestemme faktorer, der er vigtige i L. pneumophila virulens, der beskriver et nyt værktøj til at støtte vores forståelse af denne komplekse patogen.
Dyremodeller for infektion har vist sig at være uvurderlig ved bestemmelse af bakterielle virulensfaktorer. Imidlertid har hvirvelløse modeller opnået øget opmærksomhed som et levedygtigt alternativ til traditionelle pattedyr modeller for infektion. Larver af voks møl er Galleria mellonella i stigende grad anvendt til at undersøge en række vigtige humane patogener, herunder Gram-positive 1 og Gram-negative bakterier 2,3 og flere patogene svampe 4,5. Ved hjælp af et insekt model har en række fordele frem for traditionelle pattedyr modeller, som en invertebrat, G. mellonella er ikke underlagt de etiske begrænsninger af pattedyr modeller. Desuden kan larverne let fastholdes smittet ved injektion uden bedøvelse undergår forbehandling med kemiske inhibitorer 6 og opretholde inkubation ved 37 ° C 7. Interessant nok en god korrelation mellem patogeniciteten af flere mikroorganismer i G. mellonella og pattedyr modeller af infektion er etableret 2,8. Den øgede forståelse af immunsystemet G. mellonella har også bistået i karakteriseringen af denne model organisme. Selvom insekter ikke har en adaptive immunsystem, som findes i pattedyr, har de avancerede cellulære og humerus forsvar, inklusive fremstilling af antimikrobielle peptider 9. Hæmocytter er vigtig mediator af cellulære forsvar og er den mest talrige celletype findes i hæmolymfe (eller blod) G. mellonella 10. Disse celler er professionelle fagocytter og lignende funktioner til humane makrofager og neutrofiler ved både at optage og nedværdigende bakterier i en phago-lysosomale rum 10,11 og danner knuder rundt invaderende bakterier, fysisk begrænsende bakteriereplikation 12.
Legionella pneumophila er en respiratorisk patogen, der forårsager alvorlig pneumonien (Legionærsyge) hos modtagelige populationer såsom ældre eller immunsupprimerede 13.. Legionella findes allestedsnærværende i både miljø-og menneskeskabte vandkilder, hvor det er et patogen for forskellige arter af ferskvand amøber 14,15. Legionella overlever og replikerer i disse professionelle fagocytter ved anvendelse af en multi-protein-kompleks kendt som Dot / Icm (mangelfuld organel handel / intracellulær formering) type 4 sekretionssystem (T4SS) til at translokere over 275 effektor-proteiner i værtscellen 16-20. Disse proteiner tjener til at undergrave de normale værtscelle fagocytotiske veje, der fører til oprettelsen af Legionella indeholder vakuole (LCV). LCV undgår fusion med lysosomer og i stedet rekrutterer endoplasmatiske reticulum (ER)-afledte vesikler, hvilket resulterer i en specialiseret rum, der ligner den ru ER 21,22. L. pneumophila betragtes som en menneskelige fejl stiogen; de samme strategier, som gør det muligt at replikere i amøber, også tillade replikation i humane alveolære makrofager 23.
Pattedyrværter er blevet karakteriseret som modeller for humane Legionella infektion, herunder mus og marsvin 24,25. Men de fleste af musestammer er resistente over for Legionella-infektion 26 med undtagelse af den indavlede albino A / J-mus, som udvikler en mild, selvbegrænsende infektion 24. Selv marsvinemodellen mere ligner menneskelige sygdomme 25, manglen af mutanter og øgede omkostninger fraråder brugen 27.. Desuden er der udviklet flere hvirvelløse modeller for Legionella pneumophila infektion, herunder Caenorhabditis elegans 28 Drosophila melanogaster 29 og flere arter af amøber 30-32. Men disse modeller har svagheder, virulens i C. elegans </em> System er ikke Dot / Icm-afhængige 28, hvilket begrænser anvendeligheden af denne model. Drosophila-modellen har vist sig effektiv i at undersøge bakteriel virulensfaktorer 29 og synes dog at være lovende, denne model er ikke blevet fuldt karakteriseret. Encellede amøber er de miljømæssige værter L. pneumophila og er ideelle til at undersøge virkningen af virulensfaktorer på molekylært niveau 33 mangler dog flere vigtige mediatorer af pattedyrværten celle respons på infektion, såsom caspaserne 34. Svaghederne ved de eksisterende modeller, sammen med de høje omkostninger og etiske problemer forbundet med pattedyr eksperimenter, har ført til søgen efter andre passende modelorganismer 29,35.
Vi har for nylig påvist, at G. mellonella er en egnet model for L. pneumophila Patogenese 36,37. Denne protokol beskriver de eksperimentelle teknikker, der anvendes til inficerening G. mellonella larver, analysere larve moral, udvinding hæmocytter for optælling og immunfluorescens og bestemme replikation ved levedygtig CFU tæller fra inficerede larver.
Galleria mellonella larvernes model for Legionella pneumophila infektion er et nyttigt værktøj for in vivo undersøgelser af patogenese. Her er det vist, at en række aspekter af makrofag infektion kan sammenfattet i G. mellonella model, herunder den rolle, Dot / Icm T4BSS i virulens og bakteriel replikation og lokaliseringen af Dot / Icm-effektor SIDC. Derudover viser vi, at en kemisk inhibitor af actinpolymerisation reducerer larve dødelighed, efterligne resultater opnået i macophages 47 og dokumentation, at internalisering af bakterierne er forpligtet til at forårsage larvernes dødelighed. Tidligere er det blevet påvist, at variationerne i virulens mellem L. pneumophila stammer set i andre infektionsmodeller kan verificeres i G. mellonella og at induktion af virulensfaktorer i post-eksponentielle vækstfase er nødvendig for bakteriel virulens <sup> 36, der bekræfter, at G. mellonella er en egnet model for L. pneumophila infektion.
Bestemmelse af CFU L. pneumophila fra larver smittet enten enkeltvis eller i blandede infektioner øger anvendeligheden af modellen. Tidligere har flere faktorer blevet opdaget, at have subtile effekter på bakteriel replikation i en eller flere modeller af infektion 29,48-51. Selv larverne ikke besidder en adaptive immunsystem, giver tilstedeværelsen af medfødte immunreaktion stærkere markering sammenlignet med makrofager alene, der kan tjene til at forstærke subtile fænotyper. Derfor er det muligt, at mens disse stammer sandsynligvis vil ikke påvirke larvernes dødelighed, kan de demonstrere nedsat bakteriereplikation eller egnethed i G. mellonella model. Samt replikation af L. pneumophila i larverne har vi vist signifikant hemocyte udtynding sent i infektion. Som L.forventes pneumophila at lysere værtscellerne ved afslutningen af sin replikationscyklus måling hemocyte udtømning kan også tjene som en indirekte måling af bakteriel replikation. Hemocyte udtømning er tidligere blevet korreleret med insekt dødelighed infektion 3,52, selv om de seneste resultater tyder på, at dette billede er mere kompleks end første belived 37. For nylig er det blevet vist, at udsultning af larver fører til forøget modtagelighed for infektion gennem en undertrykkelse af immunreaktioner 53. I analyserne er beskrevet her, blev larverne ikke fodres for varigheden af undersøgelsen og det vides ikke, hvor godt fodret larver ville reagere på L. pneumophila infektion.
En af fordelene ved G. mellonella som en model organisme er den lethed af ekstraktion og kvantificering af hæmocytter fra inficerede larver. Tidligere videoer har vist forskellige metoder til udvinding hæmocytter fra insekter 54,55 dog opfyldthod præsenteres her er enkel og egnede til umiddelbar forarbejdning. Når udvundet, kan hæmocytter let kvantificeres, der anvendes til immunfluorescens, transmission elektronmikroskopi 36 eller flowcytometri 56 eller kulturperler og inficerede ex vivo 3 tillader cellernes reaktion på infektion, der skal undersøges nærmere. Dette øger fleksibiliteten af modellen betydeligt. En advarsel til immunfluorescens i G. mellonella er det begrænsede udbud af antistoffer valideret mod G. mellonella proteiner. Imidlertid har undersøgelser vist, at oprettelsen af antistoffer mod larvernes proteiner 57 og antistoffer mod humane immun-relaterede proteiner blev fundet at genkende G. mellonella proteiner 11 demonstrerer potentialet for immunfluorescens på G. mellonella hæmocytter.
Den lette G. mellonella infektion giver mulighed for hurtige, medium throughput skærme, der kunnebruges til at sammenligne virulensen af forskellige Legionella arter og stammer og kan anvendes til yderligere at analysere tidligere identificerede virulensfaktorer såsom adhæsionsmolekyler 58 eller type 2 sekretion systemet 59, som er nødvendige for virulens i andre modeller. Desuden vil anvendelsen af denne model er muligt at identificere og yderligere karakterisering af nye virulensfaktorer, herunder udskilte og translokeres effektor proteiner. For nylig er det blevet vist, at phospholipase C-aktivitet af L. pneumophila har en rolle i G. mellonella virulens 60 og at Dot / Icm effektor protein SdhA er nødvendig for virulens 37.. Desuden har vi for nylig vist, at der er en sammenhæng mellem de fænotyper observeret i G. mellonella og A / J mus stamme 37.
Det understreger værdien af dette værktøj til at supplere miljømæssig protozo og encellede vært og Murine infektion modeller. G. mellonella model vil blive endnu mere værdifuld i fremtiden, når den larve genomiske sekvens vil være til rådighed og flere genetiske værktøjer er etableret. Skridt i denne retning bl.a. den nylige offentliggørelse beskriver immun-relaterede transkriptom 61 og dannelsen af et initiativ for at fremme gen-nedregulering i Lepidoptera-arter 62.
Ved hjælp af G. mellonella larver, har vi en række enkle, hurtige aflæsninger af bakteriel virulens, der kan anvendes til at undersøge patogenesen af L. pneumophila. Etablering af disse analyser og bredere screening af L. pneumophila stammer og serogrupperne vil øge anvendeligheden af dette nye værktøj og vil bidrage til vores forståelse af L. pneumophila patogenese.
The authors have nothing to disclose.
CR Harding blev støttet af Wellcome Trust studentship WT086724.
Material/ Equipment | |||
ACES yeast extract (AYE) broth | 4 g ACES, 4 g yeast extract, 0.4 g α-ketoglutarate, pH 6.9, 400 ml H2O, autoclaved, 4 ml iron solution*, 4 ml cysteine solution* *add sterile ingredients after autoclaving |
||
Charcoal buffered yeast extract (CYE) plates | As above, with the addition of 0.6 g activated charcoal and 6 g agar | ||
Sterile iron solution (Ferric Pyrophosphate) | Sigma | P6526 | 0.6 mM solution, sterile filtered |
Sterile cysteine solution | Sigma | C7880 | 3.3 mM solution, sterile filtered |
G. mellonella (waxworms) | Livefood UK | W250 | |
Anti-HA-Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate (TRITC) | Sigma | H9037 | |
Anti-Legionella LPS | Cambridge Biosciences | PA1-7227 | |
Anti-Rabbit IgG Alexa488 | Jackson Immunoreach | 711-485-152 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma | I6758 | |
Dulbeccos phosphate buffered saline (D-PBS) | Sigma | D8662 | |
Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1026 | |
Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma | A9434 | |
Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | |
Digitonin | Sigma | D141 | |
Cytochalasin D | Biomol International | BML-T109-0001 | |
[header] | |||
Material | |||
Microtiter Syringe | Sigma | 24544 | |
Cell counter, double, Improved Neubauer | VWR | 631-0926 | |
Centrifuge | For centrifuging plates | ||
Fluorescence microscope | Any microscope with appropriate filters for the required fluorophores | ||
Inverted microscope | For viable cell counting | ||
Puncture-proof glove | Turtleskin |