Identifier les interactions protéine-protéine dans<em> Drosophila</em> Têtes de Tandem Affinity Purification adultes (TAP)
Summary
Drosophile est célèbre pour sa manipulation génétique puissant, mais pas pour son aptitude d'analyse biochimique en profondeur. Ici, nous présentons une procédure basée TAP à identifier les partenaires d'interaction de toute protéine d'intérêt à partir du cerveau de la mouche. Cette procédure peut potentiellement conduire à de nouvelles pistes de recherche.
Abstract
Écrans génétiques effectuées à l'aide Drosophila melanogaster (de la mouche des fruits) ont fait de nombreuses découvertes d'étape dans le progrès des sciences biologiques. Cependant, l'utilisation d'écrans biochimiques visant à étendre les connaissances acquises à partir de l'analyse génétique a été explorée que récemment. Ici, nous décrivons une méthode pour purifier le complexe de protéine qui s'associe avec n'importe quelle protéine d'intérêt à partir des têtes de mouches adultes. Cette méthode tire parti du système Drosophila GAL4/UAS d'exprimer une protéine appât fusionnée avec une étiquette Tandem Affinity Purification (TAP) dans les neurones de la mouche in vivo, puis met en œuvre deux cycles de purification en utilisant une procédure de TAP similaire à celui établi à l'origine en une levure pour purifier le complexe protéique interagissant. A la fin de cette procédure, un mélange de plusieurs complexes protéiques dont l'identité est obtenue moléculaire peut être déterminée par spectrométrie de masse. Validation des protéines candidates bénéficiera de la resource et la facilité d'effectuer des études de perte de fonction chez les mouches. Des approches similaires peuvent être appliqués à d'autres tissus de braguette. Nous pensons que la combinaison de manipulations génétiques et cette approche protéomique dans le système de modèle de la mouche détient un énorme potentiel pour résoudre les problèmes fondamentaux dans le domaine de la neurobiologie et au-delà.
Introduction
Définir les voies moléculaires ou des réseaux qui interviennent dans un processus biologique particulier est l'un des buts ultimes de la recherche biomédicale. Fly généticiens ont beaucoup compté sur la génétique à terme, en particulier modificateur écrans génétiques (deux amplificateurs et écrans suppresseurs), d'identifier les facteurs qui travaillent ensemble, en parallèle avec, ou en amont ou en aval d'un gène d'intérêt. Cependant, les écrans de génétique à terme arrive souvent ne parviennent pas à identifier les gènes essentiels qui, lorsqu'ils sont mutés, provoquent létalité à des stades précoces du développement, ou des gènes avec redondance fonctionnelle et d'indemnisation dont la perte de fonction ne causer des anomalies subtiles qui sont difficiles à marquer. Une façon de surmonter cette difficulté consiste à cribler des interactions protéine-protéine directe. Pour plus d'une décennie, un nombre croissant de méthodes biochimiques, y compris les deux hybrides de levure, phage display, réticulation chimique, Co-IP, Tandem Affinity Purification (TAP), etc. ont été utilisées pour étudier la protéine-les interactions protéiques. Chacune de ces approches a ses propres forces et faiblesses en ce qui concerne la sensibilité et la spécificité. Parmi eux, la méthode TAP permet la détection de l'interaction physique dans des conditions quasi-physiologiques, préserve la spécificité et la cohérence 2 et comprend la possibilité d'étendre à haut débit analyses 3,4.
La méthode de TAP a été développé à l'origine dans la levure par des collègues Rigautand 1. Dans ce procédé, une protéine d'intérêt est exprimé avec une étiquette de TAP. La balise TAP abrite deux domaines d'affinité de liaison indépendants: une protéine un domaine qui se lie à l'IgG et un domaine liant la calmoduline. Les deux domaines sont séparés par une TEV (Tobacco Etch Virus) site de clivage. Une telle combinaison permet à deux tours indépendantes de purifications d'affinité pour réduire suffisamment les liaisons non spécifiques et enrichissent fixations spécifiques 1. Pour ce cas, la méthode de TAP est une métho très puissantd pour identifier d'interactions in vivo d'une protéine donnée, bien que la surexpression de la protéine exogène, il peut être plus enclins à associer avec des protéines qui font normalement pas complexe avec son homologue endogène. Depuis son développement, la méthode de TAP a été appliquée dans de nombreux autres systèmes, y compris à base de culture de cellules et d'autres systèmes 5,6 vivo systèmes modèles à 6-9. Nous décrivons ici l'adaptation de la méthode de TAP chez la drosophile. On génère premier pUAST-NTAP et pUAST-CTAP vecteurs pour faciliter le clonage et la fusion de l'étiquette TAP à l'extrémité N-ou C-terminale du gène d'intérêt. Le SAMU-TAP-étiqueté transgène est ensuite exprimé dans le système nerveux sous le contrôle d'un chauffeur de GAL4 neuronale 10. Ensuite, un grand nombre de têtes de mouches adultes sera recueillie, qui ont une teneur élevée en cellules neurales et sont faciles à séparer des autres parties du corps après congélation en fonction des différences de taille. Les têtes d'adultes sont homogénéisés et dégagé bcentrifugations successives y et le surnageant est soumis à une procédure de TAP décrit ci-dessous.
Protocol
Representative Results
Discussion
Procédé de purification par affinité en tandem (TAP) propose un protocole de double purification permettant l'isolement et l'enrichissement des complexes de protéines à travers deux étapes indépendantes de purification d'affinité. La conception de l'étiquette TAP n'est pas limitée à ce qui est présenté dans ce protocole, d'autres domaines et motifs de liaison de protéines sont également applicables si les conditions tampons sont ajustés en conséquence. Un bon exemple d'autres…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions EUROSARF de nous envoyer la levure TAP plasmides d'expression. Nous sommes également reconnaissants de l'aide éditoriale de Ryan Labadens. Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH / NINDS (R01NS070962) à CW
Materials
| U.S.A. standard test sieve No. 25 | Fisher Scientific | 04-881-18 | |
| U.S.A. standard test sieve No. 40 | Fisher Scientific | 04-881-21 | |
| Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml | Kimble Chase | 885300-0015 | |
| IgG sepharose beads | Pharmacia | 17-0969-01 | |
| Econo-column 0.7 cm x 20 cm | Bio-Rad | 737-4721 | |
| Econo-column 0.5 cm x 15 cm | Bio-Rad | 737-4716 | |
| Calmodulin beads | Stratagene | 214303 | |
| Coors Mortar and Pestle | CoorsTek | 60311 | |
| AcTEV Protease | Invitrogen | 12575-015 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Protease Inhibitor Mix | Sigma | P8340 |
References
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