단백질 - 단백질 상호 작용을 확인<em> 초파리</em탠덤 선호도 정화로> 성인 머리 (TAP)
Summary
초파리는하지만 깊이있는 생화학 적 분석의 적합성에 대한, 강력한 유전자 조작으로 유명합니다. 여기에서 우리는 파리의 뇌에서 관심의 단백질의 상호 작용 파트너를 식별 할 수있는 TAP 기반의 절차를 제시한다. 이 절차는 잠재적으로 연구의 새로운 길을 초래할 수 있습니다.
Abstract
초파리 melanogaster의 (초파리)를 사용하여 실시 유전 화면은 생명 과학의 발전에 많은 이정표 발견을 만들었습니다. 그러나, 유전자 분석에서 얻은 지식을 연장 겨냥 생화학 스크린의 사용은 단지 최근 탐구 하였다. 여기에서 우리는 단백질 복합체를 정화 할 수있는 방법을 설명하는 성인 플라이 헤드 관심의 단백질과 동료. 이 방법은 생체 내에서 비행 신경에있는 탠덤 선호도 정화 (TAP) 태그와 융합 미끼 단백질을 발현하는 초파리 GAL4/UAS 시스템을 활용하고 원래 년에 설립 된 것과 유사한 TAP 절차를 사용하여 정화의 두 라운드를 구현 상호 작용하는 단백질 복합체를 정제하는 효모 1. 이 절차의 끝에서, 다중 단백질 복합체의 혼합물을 그 분자 신원 질량 분석법에 의해 결정될 수있다 얻어진다. 후보 단백질의 유효성 검사는 R 도움이됩니다esource과 파리에서 손실의 기능 연구를 수행의 용이성. 유사한 접근법이 다른 플라이 조직에 적용될 수있다. 우리는 비행 모델 시스템에서 유전자 조작이 단백질 체학 접근 방식의 조합은 신경 생물학 분야와 넘어 근본적인 문제를 다루기위한 엄청난 잠재력을 보유하고 있다고 생각합니다.
Introduction
특정 생물 학적 과정을 중재하는 분자 경로 또는 네트워크를 정의하는 것은 생물 의학 연구의 궁극적 인 목표 중 하나입니다. 비행 유전 학자, 특히 병렬로 함께 작동, 또는 상류 또는 그 유전자의 하류 요인을 식별하는 유전자 화면 (증강 및 회로 화면을 모두) 수정, 앞으로 유전학에 크게 의존했다. 그러나, 앞으로 유전학 화면은 종종 변이 된 경우, 그 손실 함수의 유일한 득점하기 어려운 미묘한 결함의 원인이 기능 중복 및 보상 초기 발달 단계에서 치사, 또는 유전자를 일으키는 원인이되는, 필수 유전자를 확인하기 위해 실패합니다. 이러한 어려움을 극복하는 방법 중 하나는 직접 단백질 – 단백질 상호 작용에 대한 화면이다. 이상 10 년 동안 등 효모 두 하이브리드, 파지 디스플레이, 화학 가교, 공동 IP, 탠덤 선호도 정화 (TAP), 등의 생화학 적 방법의 성장 목록. 단백질을 조사하기 위해 사용되어왔다- 단백질 상호 작용. 각각의 방법은 장점과 민감도와 특이도에 관해서 약점 자체 집합이 있습니다. 그 중에서도, TAP 방식은, 거의 생리적 조건 하에서 물리적 상호 작용의 검출을 허용 특이성 및 일관성이 유지되고 3,4 분석 높은 처리량을 확장 할 수있는 능력을 포함한다.
TAP 방법은 원래 Rigautand 동료 (1)에 의해 효모에 개발되었다. 이 방법에서는, 그 단백질은 TAP 태그로 표현된다. 단백질의 IgG에 결합 도메인과 칼 모듈 린 결합 도메인 : TAP 태그는 두 개의 독립적 인 친 화성 결합 도메인을 항구. 두 도메인은 TEV (담배 식각 바이러스) 절단 부위로 구분됩니다. 선호도 않는 정화의 두 개의 독립적 인 라운드가 충분히 특이 현상이 바인딩을 줄이고 특정 바인딩 1을 풍성하게하는 그런 조합 할 수 있습니다. 이것은 예를 들어, TAP 방식은 매우 강력하다 메 톡시외래 단백질을 과발현하는 것은 일반적으로 그 내생 대응 복잡한하지 않는 단백질과 연결하기가 더 많은 경향이 만들 수 있지만, 특정 단백질의 생체 내 상호 작용을 식별하기 위해 개발. 개발 이후, TAP 방법은 세포 배양 기반 시스템 5,6 및 기타 생체 내 모델 시스템 6-9 포함하여 많은 다른 시스템에 적용되었습니다. 여기에서 우리는 초파리의 TAP 방법의 적응을 설명합니다. 우리는 먼저 그 유전자의 N-또는 C-말단 하나에 TAP 태그의 복제 및 융합을 촉진하기 위해 pUAST-NTAP 및 pUAST-CTAP 벡터를 생성합니다. UAS-TAP-태그 된 트랜스이어서 신경 GAL4 드라이버 (10)의 제어하에 신경계에서 발현된다. 다음으로, 성인 플라이 헤드의 다수의 신경 세포의 높은 함량을 가지고 사이즈 차이에 기초하여 고정한 후 다른 신체 부위로부터 분리하기 쉽고, 이는 모아질 것이다. 성인 머리 균질화 지울 B입니다Y 연속 centrifugations, 상층 액은 아래에 설명 TAP 절차의 적용을받습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
탠덤 선호도 정화 (TAP) 메서드는 두 개의 독립적 인 친 화성 정제 단계를 통해 분리 및 단백질 단지의 농축을 할 수있는 듀얼 정화 프로토콜을 제공합니다. TAP 태그의 디자인이 프로토콜에 제시되어 무엇에 한정되지 않고 버퍼 조건을 적절하게 조정하는 경우, 다른 단백질 결합 도메인 및 모티프도 적용 할 수 있습니다. 다른 TAP 태그의 좋은 예는 GS-TAP 태그, G 단백질의 조합 배양 포유 동물 세포 라…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 우리에게 효모 TAP 발현 플라스미드를 보내는 EUROSARF 감사합니다. 우리는 또한 라이언 Labadens에서 편집의 도움에 감사합니다. 이 작품은 CW에 NIH / NINDS 부여 (R01NS070962)에 의해 지원되었다
Materials
| U.S.A. standard test sieve No. 25 | Fisher Scientific | 04-881-18 | |
| U.S.A. standard test sieve No. 40 | Fisher Scientific | 04-881-21 | |
| Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml | Kimble Chase | 885300-0015 | |
| IgG sepharose beads | Pharmacia | 17-0969-01 | |
| Econo-column 0.7 cm x 20 cm | Bio-Rad | 737-4721 | |
| Econo-column 0.5 cm x 15 cm | Bio-Rad | 737-4716 | |
| Calmodulin beads | Stratagene | 214303 | |
| Coors Mortar and Pestle | CoorsTek | 60311 | |
| AcTEV Protease | Invitrogen | 12575-015 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Protease Inhibitor Mix | Sigma | P8340 |
References
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