Cytotoxicity की सतत और वास्तविक समय निगरानी के लिए स्वतंत्र Bioluminescent स्तनधारी कोशिकाओं
Summary
बैक्टीरियल bioluminescence जीन कैसेट व्यक्त स्तनधारी कोशिकाओं (<em> लक्स</em>) स्वायत्त प्रकाश पैदा करते हैं. रासायनिक जोखिम पर जिसके परिणामस्वरूप bioluminescent गतिशीलता इन कोशिकाओं को आसानी से उच्च throughput स्वचालन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि एक सस्ती, सतत, वास्तविक समय विषाक्तता स्क्रीनिंग उपकरण बना रही है, सेलुलर वृद्धि और चयापचय पर उपचार के प्रभाव को प्रतिबिंबित करने के लिए प्रदर्शन किया गया है.
Abstract
स्तनधारी सेल आधारित इन विट्रो assays में व्यापक रूप से विषाक्तता अध्ययन के लिए पशु परीक्षण के लिए विकल्प के रूप में नियोजित किया गया है, लेकिन कारण जुगनू luciferase आधारित स्क्रीनिंग तरीकों के विनाशकारी प्रकृति के लिए जरूरी हो जाता है कि समानांतर नमूना तैयार करने की उच्च मौद्रिक और समय की लागत के कारण सीमित कर दिया गया है . इस वीडियो ब्याज की चक्रवृद्धि की साइटोटोक्सिक प्रभाव की निगरानी के लिए एक सस्ता और सरल विधि के रूप में, एक luciferin सब्सट्रेट के विनाशकारी अलावा आवश्यकता नहीं है, जो स्वायत्त bioluminescent स्तनधारी कोशिकाओं के उपयोग का वर्णन करता है. स्थिरतापूर्वक पूर्ण बैक्टीरियल bioluminescence (luxCDABEfrp) जीन कैसेट व्यक्त स्तनधारी कोशिकाओं स्वायत्त एक ऑप्टिकल संकेत है कि उत्पादन एक बाह्य ऊर्जा स्रोत, या पारंपरिक रूप से है कि नमूने के विनाश से एक महंगी और संभवतः हस्तक्षेप luciferin सब्सट्रेट, उत्तेजना के अलावा बिना 490 एनएम पर चोटियों ऑप्टिकल इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान प्रदर्शनएस. बाहरी उत्तेजना से इस स्वतंत्रता परिणामी संकेत केवल सक्रिय चयापचय के दौरान पता लगाया है, जिसका अर्थ है कि केवल सेल पर bioluminescent प्रतिक्रिया को बनाए रखने के लिए बोझ स्थानों. Bioluminescent उत्पादन में परिवर्तन सेलुलर वृद्धि और चयापचय पर प्रतिकूल प्रभाव का संकेत कर रहे हैं क्योंकि यह विशेषता लक्स व्यक्त सेल लाइन साइटोटोक्सिक प्रभाव के खिलाफ एक biosentinel के रूप में उपयोग के लिए एक उत्कृष्ट उम्मीदवार बनाता है. इसी प्रकार, आवश्यक नमूना विनाश के स्वायत्त प्रकृति और कमी विषैला जोखिम की अवधि के दौरान वास्तविक समय में एक ही नमूना के दोहराया इमेजिंग परमिट और एक स्वचालित फैशन में मौजूदा इमेजिंग उपकरणों का उपयोग कर कई नमूने भर में प्रदर्शन किया जा सकता है.
Introduction
वे खाद्य एवं औषधि प्रशासन द्वारा उपभोक्ता उपयोग के लिए मंजूरी दे दी है इससे पहले अमेरिका में, मानव उपभोग के लिए इरादा दवाइयों और अन्य उत्पादों के व्यापक मूल्यांकन की आवश्यकता है. इस परीक्षण के प्रदर्शन के लिए वित्तीय बोझ काफी हद तक उपभोक्ताओं के लिए एक वृद्धि की लागत में नए परिसर के विकास और इसलिए अनुवाद की लागत बढ़ जाती है जो डेवलपर 1, पर रखा गया है. इस स्क्रीनिंग के पारंपरिक रूप से बहुत मानव मेजबान के लिए परदे के पीछे के रूप में कार्य करने के लिए पशु विषयों का उपयोग किया गया है, यह (Tox / ADME सोखना, वितरण, चयापचय, उत्सर्जन, और विषाक्तता पर सालाना खर्च एक अनुमान के अनुसार $ 2800000000, के साथ एक बड़े वित्तीय बोझ साबित हो गया है ) अकेले स्क्रीनिंग 2 और पशु मॉडल मज़बूती से मानव विषाक्तता प्रतिक्रियाओं 3 भविष्यवाणी नहीं कर सकते हैं सुझाव है कि बढ़ते सबूत. इसलिए, इन विट्रो मानव सेल संस्कृति आधारित परीक्षण में है क्योंकि इसके अपेक्षाकृत कम की पिछले दो दशकों में लोकप्रियता हासिल की हैलागत, उच्च throughput, और मानव जैव उपलब्धता और विष विज्ञान 4 का बेहतर प्रतिनिधित्व. वर्तमान सेल संस्कृति आधारित विषाक्तता स्क्रीनिंग तरीकों सेलुलर व्यवहार्यता 5 का मूल्यांकन करने के लिए, सेलुलर झिल्ली की अखंडता की जांच, या mitochondrial गतिविधि के स्तर पर नज़र रखने, endogenously उपलब्ध साइटोप्लाज्मिक एंजाइमों की गतिविधि स्क्रीनिंग, ऐसे एटीपी के स्तर की माप के रूप में विभिन्न endpoints, रोजगार , 6. माप इस प्रकार केवल एक ही समय बिंदु पर डेटा उत्पादन लिया जा सकता है हालांकि, इससे पहले की परवाह किए बिना चुना समापन बिंदु, इन तरीकों के सभी नमूने के विनाश की आवश्यकता होती है. नतीजतन, नमूने की बड़ी संख्या तैयार करने और बुनियादी विषाक्तता कैनेटीक्स पढ़ाई के लिए समानांतर में इलाज किया, फिर नए परिसर के विकास के लिए आवश्यक लागत और श्रम को जोड़ने की जरूरत है. वैकल्पिक रूप से, का उपयोग कर assays के ऐसे Gaussia luciferase 7, Vargula luciferase 8, और Metridia luciferase 9 के रूप में luciferase स्रावितसेल के लिए समाप्त करने की जरूरत है और समापन बिंदु माप के लिए मीडिया के एक अंश की आवश्यकता होती है, हालांकि, यह अभी भी पूर्व निर्धारित समय बिंदुओं पर नमूना लेने तक ही सीमित हैं और भी एक्सोजेनस प्रकाश को सक्रिय substrates के अलावा आवश्यकता है कि विकसित किया गया है.
अपेक्षित नमूना विनाश की हानि के साथ ही substrates की लागत को खत्म करने से बचने के लिए एक मानव कोशिका लाइन इसी तरह की है कि जीवित कोशिकाओं की सतत निगरानी के लिए अनुमति देने के लिए पूरा बैक्टीरियल bioluminescence (लक्स) जीन कैसेट (luxCDABEfrp) व्यक्त अंजाम दिया गया है फ्लोरोसेंट डाई आधारित जीना सेल इमेजिंग के लिए, लेकिन अतिरिक्त फोटोन को सक्रिय और सूक्ष्म जांच प्रक्रिया के बिना. यह सेल लाइन इस प्रकार नमूना के विनाश से बचने, अनिवार्यता से बाहरी उत्तेजना के लिए आवश्यकता के बिना सतत, प्रत्यक्ष पता लगाने के लिए एक ऑप्टिकल संकेत उत्पादन करने में सक्षम है. Mechanistically, इन कोशिकाओं से उत्पन्न bioluminescent संकेत परिणामएस luxAB का गठन luciferase एंजाइम कम राइबोफ्लेविन फॉस्फेट की उपस्थिति (एफआरपी जीन द्वारा FMN से साफ किया है जो FMNH 2, में एक लंबी श्रृंखला फैटी एल्डिहाइड (अंतर्जात substrates का उपयोग luxCDE जीन उत्पादों से संश्लेषित और पुनर्जीवित) के ऑक्सीकरण catalyzes जब उत्पाद) और आणविक ऑक्सीजन 10. मेजबान सेल में लक्स कैसेट की अभिव्यक्ति इसलिए उत्पादन और सेलुलर विनाश या एक्सोजेनस सब्सट्रेट अलावा बिना पता लगाया जा प्रकाश में सक्षम बनाता है. इसी तरह, लक्स जीन और endogenously उपलब्ध FMN, और ओ 2 cosubstrates, और FMNH 2 से FMN के रूपांतरण का समर्थन कर सकते हैं कि एक पर्यावरण के रखरखाव के लिए आवश्यकता के बीच बातचीत के परिणामस्वरूप bioluminescent संकेत ही रहने से पता लगाया जा सकता है कि यह सुनिश्चित करता है , metabolically सक्रिय कोशिकाओं.
इन जरूरतों पहले कि लक्स बस को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैएड bioluminescent उत्पादन सेलुलर जनसंख्या आकार 11 और उस विषाक्त यौगिक जोखिम एक खुराक प्रतिक्रिया फैशन 12 में autobioluminescent उत्पादन impairs के साथ दृढ़ता से संबद्ध है. यहाँ हम विषाक्तता परीक्षण के लिए autobioluminescent स्तनधारी कोशिकाओं के आवेदन को मान्य करने के लिए एक प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में जाना जाता डीएनए हानिकारक गतिविधि के साथ bleomycin परिवार के एक एंटीबायोटिक के स्वचालित विषाक्तता स्क्रीनिंग प्रदर्शित करने के लिए एक पहले से विशेषता autobioluminescent मानव भ्रूण गुर्दे (HEK293) सेल लाइन 11 का उपयोग करें.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस विधि जीवित कोशिकाओं लगातार उनके जीवनकाल में नजर रखी जा करने की अनुमति देता है कि इन विट्रो cytotoxicity स्क्रीनिंग परख में एक के रूप में स्वतंत्र रूप bioluminescent स्तनधारी कोशिकाओं के उपयोग को दर्शाता है. इ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ये शोध प्रयासों रासायनिक, जैव अभियांत्रिकी, पर्यावरण, और पुरस्कार संख्या CBET-0853780 और CBET-1159344 और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, पर्यावरणीय स्वास्थ्य विज्ञान के राष्ट्रीय संस्थान (NIEHS) के तहत परिवहन (CBET) सिस्टम के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन प्रभाग द्वारा समर्थित थे पुरस्कार संख्या 1R43ES022567-01, और राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, पुरस्कार संख्या CA127745-01 के तहत कैंसर इमेजिंग प्रोग्राम के तहत. इस काम में इस्तेमाल IVIS Lumina साधन अमेरिकी सेना रक्षा विश्वविद्यालय अनुसंधान इंस्ट्रूमेंटेशन कार्यक्रम से प्राप्त हुई थी.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comment |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Newer updates of this software is available | |
| 75 cm2 cell culture treated flasks | Corning | 430641 | |
| 6-well tissue culture-treated plates | Costar | 07-200-83 | |
| Black 24-well plate | Greiner Bio-One | 662174 | 96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications |
| Phosphate buffered saline | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free | Hyclone | SH30284 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH3091003 | |
| Nonessential amino acids, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibiotic-antimycotic, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Sodium pyruvate, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
References
- U.S. Food and Drug Administration. Is it really FDA approved?. FDA Consumer Health Information. 2, (2009).
- Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharmacol. 32, 56-67 (2000).
- Stacey, G. Current developments in cell culture technology. Adv. Exp. Med. Biol. 745, 1-13 (2012).
- Li, A. P. Screening for human ADME/Tox drug properties in drug discovery. Drug Discov. Today. 6, 357-366 (2001).
- Li, A. P. In vitro approaches to evaluate ADMET drug properties. Curr. Top. Med. Chem. 4, 701-706 (2004).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat. Protoc. 4, 582-591 (2009).
- Thompson, E. M., Nagata, S., Tsuji, F. I. Cloning and expression of cDNA for the luciferase from the marine ostracod Vargula hilgendorfii. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 6567-6571 (1989).
- Lupold, S. E., Johnson, T., Chowdhury, W. H., Rodriguez, R. A real time Metridia luciferase based non-invasive reporter assay of mammalian cell viability and cytotoxicity via the beta-actin promoter and enhancer. PLoS ONE. 7, (2012).
- Meighen, E. A. Molecular biology of bacterial bioluminescence. Microbiol. Rev. 55, 123-142 (1991).
- Close, D. M., et al. Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line. PLoS ONE. 5, e12441 (2010).
- Close, D. M., Hahn, R. E., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Determining toxicant bioavailability using a constitutively bioluminescent human cell line. , 1-4 (2011).
- Oliva-Trastoy, M., Defais, M., Larminat, F. Resistance to the antibiotic Zeocin by stable expression of the Sh ble gene does not fully suppress Zeocin-induced DNA cleavage in human cells. Mutagenesis. 20, 111-114 (2005).
- Close, D. M., Webb, J. D., Ripp, S. A., Patterson, S. S., Sayler, G. S. Remote detection of human toxicants in real time using a human optimized bioluminescent bacterial luciferase gene cassette bioreporter. Proc. SPIE 8371, Sensing Technologies for Global Health, Military Medicine, Disaster Response, and Environmental Monitoring II; and Biometric Technology for Human Identification IX. 837117, (2012).
- Close, D. M., Hahn, R. E., Patterson, S. S., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Comparison of human optimized bacterial luciferase, firefly luciferase, and green fluorescent protein for continuous imaging of cell culture and animal models. J. Biomed. Opt. 16, e12441 (2011).
