Células de mamíferos autonomamente bioluminescentes para monitoramento contínuo e em tempo real de citotoxicidade
Summary
As células de mamífero que expressam a cassete de gene de bioluminescência (<em> Lux</em>) Produzem luz de forma autônoma. A dinâmica bioluminescentes resultantes após a exposição química têm sido demonstrados para reflectir os efeitos do tratamento sobre o crescimento e metabolismo celular, tornando essas células um, contínuo e em tempo real ferramenta de rastreio de toxicidade baixo custo que pode ser facilmente adaptado para a automatização de alto rendimento.
Abstract
Células de mamíferos com base em ensaios in vitro têm sido amplamente empregados como alternativas aos testes em animais para estudos toxicológicos, mas foram limitados devido aos altos custos monetários e de tempo de preparação da amostra paralela que sejam necessárias devido à natureza destrutiva do vaga-lume métodos de rastreio baseados luciferase . Este vídeo descreve a utilização de células de mamífero de forma autónoma bioluminescentes, que não requerem a adição de um substrato destrutiva luciferina, tal como um método barato e fácil para a monitorização dos efeitos citotóxicos de um composto de interesse. As células de mamíferos que expressem estavelmente a bioluminescência completo (luxCDABEfrp) cassete do gene autonomamente produzirem um sinal óptico que um pico a 490 nm, sem a adição de um substrato luciferina caro e, possivelmente interferindo, a excitação por uma fonte de energia exterior ou a destruição da amostra que é tradicionalmente realizado durante o procedimento de imagiologia ópticas. Esta independência de estimulação externa coloca o fardo para manter a reacção bioluminescente unicamente sobre a célula, o que significa que o sinal resultante é detectado apenas activo durante o metabolismo. Esta característica faz com que a linha de células de lux que expressam um excelente candidato para o uso como um biosentinel contra os efeitos citotóxicos por causa mudanças na produção bioluminescente são indicativos de efeitos negativos sobre o crescimento e metabolismo celular. Do mesmo modo, a natureza autónoma e falta de destruição da amostra requerida permite imagiologia repetida da mesma amostra em tempo real ao longo do período de exposição tóxico e pode ser realizada através de várias amostras utilizando o equipamento existente de imagem de uma forma automatizada.
Introduction
Em os EUA, farmacêuticos e outros produtos destinados ao consumo humano requer ampla avaliação antes de serem aprovadas para uso do consumidor pela Food and Drug Administration. Os encargos financeiros para executar este teste é colocada no revelador 1, o que aumenta substancialmente os custos de desenvolvimento de novos compostos e, portanto, se traduz num aumento de custos para os consumidores. Enquanto, tradicionalmente, grande parte desta seleção utilizou assuntos animais para atuar como proxies para hospedeiros humanos, este provou ser um grande ônus financeiro, com um valor estimado de 2,8 bilhões dólares gastos anualmente em ADME / Tox (absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade ) triagem sozinho 2 e evidências sugerindo que os modelos animais não é possível prever com segurança respostas toxicológicos humanos 3. Por conseguinte, os testes in vitro de células humanas à base de cultura ganhou popularidade nos últimos dois décadas devido à sua relativamente baixade custos, maior produtividade e melhor representação de biodisponibilidade humana e toxicologia 4. Baseados em métodos de rastreio de cultura celular correntes toxicidade empregar vários parâmetros, tais como a medição de níveis de ATP, o rastreio da actividade de enzimas citoplasmáticos endogenamente disponíveis, sondando a integridade da membrana celular, ou o seguimento do nível de actividade mitocondrial, para avaliar a viabilidade celular 5 , 6. No entanto, independentemente da extremidade escolhido, estes métodos requerem a destruição da amostra antes da medição pode ser feita, portanto, apenas a produção de dados num único ponto de tempo. Como resultado, um grande número de amostras têm de ser preparados e tratados em paralelo para estudos toxicológicos básicos cinética, mais uma vez aumentando o custo e o trabalho necessários para o desenvolvimento de novos compostos. Em alternativa, os ensaios de luciferase utilizando secretada como Gaussia luciferase 7, Vargula luciferase 8 e 9 Metridia luciferasetêm sido desenvolvidos, que eliminam a necessidade de lise celular e necessitam de uma fracção dos meios para a medição de ponto de extremidade, no entanto, estes ainda estão limitados a amostragem em pontos de tempo predeterminados e também requerer a adição de substratos exógenos de luz de activação.
Para evitar o detrimento da destruição da amostra requerida, bem como para eliminar o custo de substratos, uma linha celular humana foi modificado que expressa a bioluminescência completo (lux), cassete do gene (luxCDABEfrp) para permitir a monitorização contínua de células vivas que é semelhante para imagens de células vivas com base fluorescente-dye, mas sem os procedimentos adicionais de investigação photon-ativadores e microscópica. Esta linha celular é capaz de constitutivamente produzindo um sinal óptico para a detecção contínua, directa, sem a necessidade de estimulação externa, evitando assim a destruição da amostra. Mecanisticamente, o sinal bioluminescente gerado a partir destas células resultars quando a enzima luciferase luxAB formada catalisa a oxidação de um aldeído gordos de cadeia longa (sintetizado e regenerado pelos produtos do gene luxCDE utilizando os substratos endógenos), na presença de riboflavina fosfato reduzido (FMNH 2, que é reciclada a partir de FMN pelo gene frp produto) e oxigénio molecular 10. A expressão da cassete de lux na célula hospedeira, por conseguinte, permite que a luz seja produzida e detectada sem destruição celular ou adição de substrato exógeno. Da mesma forma, a interação entre os genes lux ea FMN disponível endogenamente, e O dois co-substratos, bem como a exigência de manutenção de um ambiente capaz de suportar a conversão de FMN para FMNH 2, garante que o sinal bioluminescente resultante só pode ser detectada de viver as células activas metabolicamente.
Estes requisitos foram anteriormente explorados para demonstrar que lux-bassaída bioluminescente ed correlaciona fortemente com o tamanho da população celular 11 e que a exposição composto tóxico prejudica a produção autobioluminescent de uma forma dose-resposta 12. Aqui usamos um autobioluminescent rim embrionário humano previamente caracterizadas (HEK293) 11 linha de células para demonstrar a triagem automatizada toxicológico de um antibiótico da família da bleomicina com ADN conhecida actividade prejudicial como um exemplo representativo, para validar a aplicação de células de mamífero autobioluminescent para os ensaios de toxicidade.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método demonstra o uso de células de mamíferos bioluminescentes autonomamente como um ensaio de rastreio de citotoxicidade in vitro que permite que as células vivas de ser monitorada continuamente durante a sua vida. Este protocolo é flexível e pode ser modificado para acomodar condições experimentais específicas, conforme necessário. Por exemplo: a experiência aqui apresentada é apropriada para rastrear os efeitos tóxicos agudos, mas pode ser adaptado para avaliar efeitos de actuaç?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estes esforços de pesquisa foram apoiadas pela Divisão de Ciência da Fundação Nacional de Química, Bioengenharia, ambiental e sistemas de transporte (CBET) sob os números prêmio Instituto Nacional de Ciências de Saúde Ambiental (NIEHS) CBET e CBET-0853780-1159344 e do National Institutes of Health, sob o número prêmio 1R43ES022567-01, e do Instituto Nacional do Câncer, do Programa de Imagem Câncer sob o número prêmio CA127745-01. O IVIS Lumina instrumento utilizado neste trabalho foi obtido a partir do Programa de Instrumentação Exército dos EUA Defense University Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comment |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Newer updates of this software is available | |
| 75 cm2 cell culture treated flasks | Corning | 430641 | |
| 6-well tissue culture-treated plates | Costar | 07-200-83 | |
| Black 24-well plate | Greiner Bio-One | 662174 | 96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications |
| Phosphate buffered saline | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free | Hyclone | SH30284 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH3091003 | |
| Nonessential amino acids, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibiotic-antimycotic, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Sodium pyruvate, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
References
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