Las células de mamíferos bioluminiscentes manera autónoma para la monitorización continua y en tiempo real de citotoxicidad
Summary
Las células de mamífero que expresan el casete del gen bioluminiscencia bacteriana (<em> Lux</em>) Producir luz autónoma. La dinámica bioluminiscentes resultantes tras la exposición química se han demostrado para reflejar los efectos de los tratamientos sobre el crecimiento celular y el metabolismo, haciendo que estas células una herramienta barata, continua, en tiempo real toxicidad de detección que puede ser fácilmente adaptado para la automatización de alto rendimiento.
Abstract
Células de mamíferos basado en ensayos in vitro han sido ampliamente empleada como alternativas a los ensayos con animales para los estudios toxicológicos, pero se han limitado debido a los altos costos monetarios y el tiempo de preparación de la muestra paralela que se hicieron necesaria debido a la naturaleza destructiva de los métodos de detección basados en luciferasa de luciérnaga . Este video describe la utilización de células de mamíferos bioluminiscentes forma autónoma, que no requiere la adición destructiva de un sustrato de luciferina, como un método económico y fácil para el seguimiento de los efectos citotóxicos de un compuesto de interés. Las células de mamífero que expresan establemente la bioluminiscencia bacteriana completo (luxCDABEfrp) casete del gen autónoma producen una señal óptica que picos a 490 nm sin la adición de un sustrato de luciferina caro y posiblemente interferir, de excitación por una fuente de energía externa, o la destrucción de la muestra que es tradicionalmente realizado durante el procedimiento de formación de imágenes ópticass. Esta independencia de la estimulación externa coloca la carga para el mantenimiento de la reacción bioluminiscente únicamente en la célula, lo que significa que la señal resultante sólo se detecta durante el metabolismo activo. Esta característica hace que la línea de células de lux que expresan un excelente candidato para el uso como un biosentinel contra los efectos citotóxicos debido a cambios en la producción bioluminiscente son indicativos de efectos adversos sobre el crecimiento celular y el metabolismo. Del mismo modo, el carácter autónomo y la falta de la destrucción de la muestra requerida permite formación de imágenes repetidas de la misma muestra, en tiempo real durante todo el período de exposición tóxica y se pueden realizar a través de múltiples muestras de imagen utilizando el equipo existente de forma automatizada.
Introduction
En los EE.UU., los productos farmacéuticos y otros productos destinados al consumo humano requieren una evaluación extensiva antes de que sean aprobados para su uso por el consumidor por la Administración de Alimentos y Drogas. La carga financiera para la realización de esta prueba se coloca en el desarrollador de 1, lo que aumenta sustancialmente el coste de desarrollo compuesto nuevo y por lo tanto, se traduce en un aumento de coste para los consumidores. Si bien tradicionalmente la mayor parte de este examen ha utilizado materias animales para actuar como representantes de los huéspedes humanos, esto ha demostrado ser una gran carga financiera, con un estimado de 2,8 mil millones dólares gastados anualmente en ADME / Tox (absorción, distribución, metabolismo, excreción y toxicidad ) seleccionar solo 2 y la creciente evidencia que sugiere que los modelos animales no pueden predecir con certeza las respuestas toxicológicas humanos 3. Por lo tanto, las pruebas basadas en el cultivo de células humanas in vitro se ha ganado popularidad en las últimas dos décadas debido a su relativamente bajacoste, mayor rendimiento y una mejor representación de la biodisponibilidad humana y toxicología 4. Los métodos de cribado de toxicidad basada en el cultivo de células actuales emplean diversos criterios de valoración, tales como la medición de los niveles de ATP, la detección de la actividad de las enzimas citoplasmáticas endógenamente disponibles, el sondeo de la integridad de la membrana celular, o el seguimiento del nivel de la actividad mitocondrial, para evaluar la viabilidad celular 5 , 6. Sin embargo, independientemente del punto final elegido, todos estos métodos requieren la destrucción de la muestra antes de las mediciones se pueden tomar, por tanto, sólo la producción de datos en un solo punto de tiempo. Como resultado de ello, un gran número de muestras tienen que ser preparados y tratados en paralelo para estudios básicos cinética toxicológicos, de nuevo añadiendo al coste y mano de obra requerida para el nuevo desarrollo compuesto. Alternativamente, los ensayos de luciferasa utilizando secretadas tales como luciferasa Gaussia 7, luciferasa de Vargula 8, 9 y Metridia luciferasase han desarrollado que elimina la necesidad de la lisis celular y requiere una fracción de los medios de comunicación para la medición de la variable, sin embargo, éstos están todavía se limita a muestreo en puntos de tiempo predeterminados y también requiere la adición de sustratos exógenos luz de activación.
Para evitar el detrimento de la destrucción de la muestra requerida, así como para eliminar el costo de sustratos, una línea celular humana ha sido diseñado que expresa la bioluminiscencia bacteriana completo (lux) casete del gen (luxCDABEfrp) para permitir la monitorización continua de células vivas que es similar de imágenes de células vivas fluorescente basado-dye, pero sin los procedimientos de investigación de fotones que activan y microscópicas adicionales. Esta línea celular es capaz de producir constitutivamente una señal óptica para la detección continua, directa y sin la necesidad de la estimulación externa, evitando así la destrucción de la muestra. Mecánicamente, la señal bioluminiscente generada a partir de estas células como resultados cuando la enzima luciferasa luxAB formado cataliza la oxidación de un aldehído graso de cadena larga (sintetizado y regenerado por los productos de los genes luxCDE usando sustratos endógenos) en presencia de la reducción de fosfato de riboflavina (FMNH 2, que se recicla desde FMN por el gen FRP producto) y oxígeno molecular 10. Por lo tanto, la expresión del casete de lux en la célula huésped permite que la luz a ser producido y detectado sin la destrucción celular o adición de sustrato exógeno. Del mismo modo, la interacción entre los genes lux y el FMN disponibles endógenamente, y O 2 co-sustratos, y los requisitos de mantenimiento de un entorno que puede apoyar la conversión de FMN a FMNH 2, asegura que la señal bioluminiscente resultante sólo puede ser detectado de vivir , las células metabólicamente activas.
Estos requisitos previamente han sido explotados para demostrar que lux-bassalida ed bioluminiscente se correlaciona fuertemente con tamaño de la población celular 11 y que la exposición compuesto tóxico perjudica la producción autobioluminescent de una manera dosis-respuesta 12. Aquí se utiliza un autobioluminescent de riñón embrionario humano previamente caracterizado (HEK293) línea celular 11 para demostrar la detección toxicológica automatizado de un antibiótico de la familia de la bleomicina con conocida actividad que daña el ADN como un ejemplo representativo para validar la solicitud de células de mamífero autobioluminescent para las pruebas de toxicidad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método demuestra el uso de células de mamíferos bioluminiscentes forma autónoma como un ensayo de cribado de citotoxicidad in vitro que permite a las células en vivo para ser controlados continuamente durante toda su vida en. Este protocolo es flexible y puede ser modificado para adaptarse a las condiciones experimentales específicas según se requiera. Por ejemplo, el experimento que aquí se presenta es adecuado para el seguimiento de los efectos tóxicos agudos, pero puede ser adaptado pa…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estos esfuerzos de investigación fueron apoyados por la División Nacional Science Foundation de la Química, Bioingeniería, Medio Ambiente y Sistemas de Transporte (CBET) bajo el número de premios CBET-0853780 y CBET-1159344 y los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental (NIEHS) bajo el número de concesión 1R43ES022567-01, y el Instituto Nacional del Cáncer, Programa de Imagen del Cáncer con el número premio CA127745-01. El instrumento IVIS Lumina utilizado en este trabajo se obtuvo del Programa de Instrumentación EE.UU. Ejército Defense University Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comment |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Newer updates of this software is available | |
| 75 cm2 cell culture treated flasks | Corning | 430641 | |
| 6-well tissue culture-treated plates | Costar | 07-200-83 | |
| Black 24-well plate | Greiner Bio-One | 662174 | 96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications |
| Phosphate buffered saline | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free | Hyclone | SH30284 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH3091003 | |
| Nonessential amino acids, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibiotic-antimycotic, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Sodium pyruvate, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
References
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