Cell Klämma som en robust, mikroflödes Intracellular Delivery Platform
Summary
Snabb mekanisk deformation av celler har vuxit fram som ett lovande, vektor-fri metod för intracellulär leverans av makromolekyler och nanomaterial. Detta protokoll ger detaljerade steg om hur man använder systemet för ett brett spektrum av applikationer.
Abstract
Snabb mekanisk deformation av celler har vuxit fram som ett lovande, vektor-fri metod för intracellulär leverans av makromolekyler och nanomaterial. Denna teknik har visat potential att ta itu med tidigare krävande tillämpningar, inklusive leverans till primära immunceller, cell omprogrammering, Nanorör och quantum dot leverans. Denna vektor fria microfluidic plattform förlitar sig på mekanisk sönderdelning av cellmembranet för att underlätta cytosoliskt leverans av målmaterialet. Häri beskriver vi den detaljerade metoden för användning för dessa mikrofluidanordningar innefattande, anordningsenheten, förberedelse cell och systemets drift. Denna leverans metod kräver en kort optimering av enhetstyp och driftsförhållanden för tidigare orapporterade applikationer. De som instruktionerna är generaliserbara till de flesta celltyper och leveransmaterial eftersom detta system inte kräver specialiserade buffertar eller kemisk modifiering / konjugation steg. Detta arbete ger ocksås rekommendationer om hur man kan förbättra enhetens prestanda och felsöka eventuella problem i samband med igensättning, låga leveranseffektivitet, och cellernas livskraft.
Introduction
Leverans av makromolekyler till cellens cytoplasma är ett kritiskt steg i terapeutiska och forskningstillämpningar. Nanopartiklar medierad leverans, till exempel, har visat potential i genterapi 1,2, medan proteinleverans är ett lovande sätt att påverka cellfunktioner i både kliniska 3 och laboratorie 4 inställningar. Andra material, såsom småmolekylära läkemedel, kvantprickar, eller guld nanopartiklar, är av intresse i allt från cancerterapi 5,6 till intracellulär märkning 7,8, och enda molekyl spårning 9.
Cellmembranet är till stor del impermeabelt för makromolekyler. Många befintliga tekniker använder polymera nanopartiklar 10,11, liposomer 12 eller kemiska modifieringar 13 för att underlätta membran störningar eller endocytotisk leverans. I dessa metoder, leveranseffektivitet och cellviabiliteten är ofta beroende av strukturen av the målmolekyl och celltypen. Dessa metoder kan vara effektiva på att leverans av strukturellt enhetliga material, såsom nukleinsyror, men är ofta dåligt anpassade för avgivning av flera strukturellt skiftande material, såsom proteiner 14,15 och nanomaterial 7. Dessutom är ofta ineffektiv endosomen störningar mekanism att de flesta av dessa metoder är beroende av, och därför lämnar mycket material instängd i vesikel strukturer 16. Slutligen, metoder som ofta är utvecklade för att användas med etablerade cellinjer inte översätta bra till primära celler.
Membranporeringsmetoder, såsom elektroporation 17,18 och sonoporation 19, är ett attraktivt alternativ i vissa program, men de är kända för att orsaka låg cellviabilitet och kan begränsas av laddningen av målet leveransmaterialet.
Rapid mekanisk deformation av celler, en mikroflödes tillvägagångssätt för leverans, har nyligen demonstratörerated dess fördelar jämfört med nuvarande tekniker i samband med cell omprogrammering 20 och nanomaterial leverans 21. Denna metod förlitar sig på mekanisk sprängning o cellmembranet för att underlätta cytosolisk avgivning av material som är närvarande i den omgivande bufferten. Systemet har visat möjliggör potential i tidigare utmanande celltyper (t.ex. primär immunceller och stamceller) och material (t.ex. antikroppar och kolnanorör). Häri är den allmänna proceduren för att använda dessa enheter för intracellulär leverans av mål makromolekyler beskrivs. Proceduren är generaliserbara till de flesta celltyper och leveransmaterial, dock är det rekommenderat att man gör en kort optimering av sjukdomstillstånd som anges i våra tidigare rapporterade designriktlinjer 20, för alla tidigare orapporterade applikationer. Hittills har systemet använts framgångsrikt för avgivning av RNA, DNA, guld nanopartiklar, kvantprickar, kolnanorör, proteins, och dextran polymerer 20,21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vissa aspekter av det beskrivna försöksförfarandet (dvs. andra än chipdesign och drifthastighet faktorer) kan behöva optimeras beroende på vilken celltyp och tillförselmaterialet systemet appliceras. Diskussionen som följer adresser några av de vanligaste faktorer att tänka på när man utformar experiment.
För att förbättra leveransen signalen för fluorescensmärkta föreningar, måste man ta itu med källor till bakgrundsfluorescens. Surface bindning och endocytos, t…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar T. Shatova för bra diskussion om experimentell design och dataanalys. Den hjälp och expertis av G. Paradis, är personalen på flödescytometri kärnan vid Koch-institutet, och personalen på Microsystems Technology Laboratory vid Massachusetts Institute of Technology tacksamt. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351, och delvis av National Cancer Institute Cancer Center Support (Kärna) Grants P30-CA14051 och MPP-09Call-Langer-60.
Materials
| Device Holder & Plastic reservoir | SQZ Biotechnologies | Holder | |
| LSRFortessa Analyzer | Becton Dickinson | N/A | Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities |
| Microfluidic device | SQZ Biotechnologies | Cell Squeeze | |
| O-Rings | McMaster | 9452K311 | |
| Pressure system to operate device | SQZ Biotechnologies | Pressure System | |
| Tweezers | |||
| Ultrasound bath |
References
- Schaffert, D., Wagner, E. Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems. Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-138 (2009).
- Leader, B., Baca, Q. J., Golan, D. E. Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 21-39 (2008).
- Kim, D., et al. Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells by Direct Delivery of Reprogramming Proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Dhar, S., Daniel, W. L., Giljohann, D. A., Mirkin, C. A., Lippard, S. J. Polyvalent Oligonucleotide Gold Nanoparticle Conjugates as Delivery Vehicles for Platinum(IV) Warheads. J. Am. Chem. Soc. 131, 14652-14653 (2009).
- Jiang, Z. -. X., Zhang, Z. -. Y. Targeting PTPs with small molecule inhibitors in cancer treatment. Cancer and Metastasis Reviews. 27, 263-272 (2008).
- Derfus, A. M., Chan, W. C. W., Bhatia, S. N. Intracellular Delivery of Quantum Dots for Live Cell Labeling and Organelle Tracking. Adv. Mater. 16, 961-966 (2004).
- Michalet, X., et al. Quantum Dots for Live Cells in Vivo Imaging, and Diagnostics. Science. 307, 538-544 (2005).
- Dahan, M., et al. Diffusion Dynamics of Glycine Receptors Revealed by Single-Quantum Dot Tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
- Slowing, I. I., Trewyn, B. G., Lin, V. S. Y. Mesoporous Silica Nanoparticles for Intracellular Delivery of Membrane-Impermeable Proteins. J. Am. Chem. Soc. 129, 8845-8849 (2007).
- Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 581-593 (2005).
- Joseph, Z. Cationic lipids used in gene transfer. Advanced Drug Delivery Reviews. 27 (97), 17-28 (1997).
- Verma, A., et al. Surface-structure-regulated cell-membrane penetration by monolayer-protected nanoparticles. Nat. Mater. 7, 588-595 (2008).
- Yan, M., et al. A novel intracellular protein delivery platform based on single-protein nanocapsules. Nat. Nano. 5, 48-53 (2010).
- Shi Kam, N. W., Jessop, T. C., Wender, P. A., Dai, H. Nanotube Molecular Transporters: Internalization of Carbon Nanotube-Protein Conjugates into Mammalian Cells. J. Am. Chem. Soc. 126, 6850-6851 (2004).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
- li, S. Electroporation Gene Therapy: New Developments In Vivo and In Vitro. Current Gene Therapy. 4, 309-316 (2004).
- Fox, M., et al. Electroporation of cells in microfluidic devices: a review. Anal. Bioanal. Chem. 385, 474-485 (2006).
- Miller, D. L., Pislaru, S. V., Greenleaf, J. F. Sonoporation: Mechanical DNA Delivery by Ultrasonic Cavitation. Somatic Cell and Molecular Genetics. 27, 115-134 (2002).
- Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 2082-2087 (2013).
- Lee, J., et al. Nonendocytic Delivery of Functional Engineered Nanoparticles into the Cytoplasm of Live Cells Using a Novel, High-Throughput Microfluidic Device. Nano Lett. 12, 6322-6327 (2012).
