الضغط خلية باعتبارها قوية، ميكروفلويديك بين الخلايا توصيل منصة
Summary
وقد برزت تشوه الميكانيكية السريع للخلايا باعتبارها، طريقة خالية من ناقلات واعدة للتسليم داخل الخلايا والجزيئات النانوية. يوفر هذا البروتوكول خطوات تفصيلية حول كيفية استخدام النظام لمجموعة واسعة من التطبيقات.
Abstract
وقد برزت تشوه الميكانيكية السريع للخلايا باعتبارها، طريقة خالية من ناقلات واعدة للتسليم داخل الخلايا والجزيئات النانوية. وقد أظهرت هذه التقنية في معالجة التطبيقات المحتملة صعبة سابقا؛ بما في ذلك، والتسليم إلى الخلايا الأولية المناعي، وإعادة برمجة الخلية، وأنابيب الكربون، والكم نقطة التسليم. تعتمد هذه المنصة خالية من ناقلات ميكروفلويديك على اضطراب الميكانيكية للغشاء الخلية لتسهيل تسليم عصاري خلوي من المواد المستهدفة. هنا، نحن تصف طريقة مفصلة لاستخدام لهذه الأجهزة ميكروفلويديك بما في ذلك، والتجمع الجهاز، وإعداد الخلايا، وتشغيل النظام. هذا النهج يتطلب التسليم الأمثل موجزة عن نوع الجهاز وظروف التشغيل للتطبيقات يبلغ عنها سابقا. الإرشادات المتوفرة هي تعميم لمعظم أنواع الخلايا والمواد التسليم وهذا النظام لا يتطلب مخازن المتخصصة أو خطوات التعديل الكيميائي / الاقتران. هذا العمل كما توفرق توصيات بشأن كيفية تحسين أداء الجهاز والمتاعب اطلاق النار على المشاكل المحتملة المتعلقة انسداد، الكفاءة تسليم منخفضة، وبقاء الخلية.
Introduction
تسليم الجزيئات إلى السيتوبلازم الخلية هو خطوة حاسمة في التطبيقات العلاجية والبحوث. جسيمات متناهية الصغر بوساطة التسليم، على سبيل المثال، أظهرت المحتملة في العلاج الجيني 1،2، بينما التسليم البروتين هو وسيلة واعدة لتؤثر على وظيفة الخلوية في كل من السريرية والمختبرية 3 4 الإعدادات. غيرها من المواد، مثل المخدرات جزيء صغير، نقاط الكم، أو جزيئات الذهب، هي ذات فائدة في تطبيقات تتراوح بين علاجات السرطان 5،6 إلى 7،8 وضع العلامات داخل الخلايا، وجزيء واحد تتبع 9.
غشاء الخلية غير منفذ إلى حد كبير الجزيئات. العديد من التقنيات القائمة استخدام الجسيمات النانوية البوليمرية 10،11، 12 الجسيمات الشحمية، أو التعديلات الكيميائية 13 لتسهيل اضطراب الغشاء أو تسليم endocytotic. في هذه الأساليب، وكفاءة التسليم وخلية حيوية تعتمد غالبا على هيكل اله الجزيء المستهدف ونوع من الخلايا. ويمكن لهذه الأساليب أن تكون فعالة في إيصال المواد موحد هيكليا، مثل الأحماض النووية، ولكن في كثير من الأحيان غير ملائمة لإيصال أكثر تنوعا من الناحية الهيكلية المواد، مثل البروتينات والمواد النانوية 14،15 7. وعلاوة على ذلك، فإن آلية تعطيل جسيم داخلي أن معظم هذه الطرق تعتمد على كثير من الأحيان غير فعالة، وبالتالي ترك الكثير من المواد المحاصرين في الهياكل حويصلة 16. أخيرا، الأساليب التي غالبا ما يتم تطويرها للاستخدام مع خطوط الخلايا التي أنشئت لا تترجم بشكل جيد إلى الخلايا الأولية.
طرق غشاء poration، مثل التثقيب الكهربائي 17،18 وsonoporation 19، وبديلا جذابا في بعض التطبيقات، ولكن من المعروف أنها تسبب انخفاض بقاء الخلية، ويمكن أن تكون محدودة من قبل المسؤول عن تسليم المواد المستهدفة.
تشوه الميكانيكية السريع للخلايا، واتباع نهج ميكروفلويديك إلى التسليم، في الآونة الأخيرة demonstrated مزاياه أكثر التقنيات الحالية في سياق إعادة برمجة الخلية 20 وتسليم المواد متناهية الصغر 21. يعتمد هذا الأسلوب على تعطيل الميكانيكية س غشاء الخلية لتسهيل تسليم عصاري خلوي من المواد الموجودة في المخزن المؤقت المحيطة بها. وقد أثبت نظام تمكين المحتملة في تحدي سابقا أنواع الخلايا (مثل الخلايا المناعية الأولية والخلايا الجذعية) والمواد (مثل الأجسام المضادة وأنابيب الكربون النانوية). هنا، يتم وصف الإجراء عامة لاستخدام هذه الأجهزة للتسليم داخل الخلايا من الجزيئات المستهدفة. هذا الإجراء هو تعميم لمعظم أنواع الخلايا والمواد التسليم، ومع ذلك، فمن المستحسن أن أحد إجراء التحسين وجيزة من الظروف، كما هو مفصل في المبادئ التوجيهية لدينا تصميم ذكرت سابقا 20، لأي طلبات غير المبلغ عنها سابقا. حتى الآن، تم استخدام النظام بنجاح لإيصال الحمض النووي الريبي، الحمض النووي، وجزيئات الذهب، نقاط الكم، أنابيب الكربون النانوية، والبروتينق، والبوليمرات ديكستران 20،21.
Protocol
Representative Results
Discussion
قد تحتاج بعض جوانب الإجراءات التجريبية وصفها (أي عوامل أخرى من تصميم رقاقة وسرعة التشغيل) ليكون الأمثل اعتمادا على نوع من الخلايا والمواد التسليم يتم تطبيق نظام ل. المناقشة التي يلي عناوين بعض العوامل الأكثر شيوعا التي يجب مراعاتها عند تصميم التجارب.
<p class="jove_c…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر T. Shatova للمناقشة مفيدة على التصميم التجريبي وتحليل البيانات. المساعدة والخبرة من G. باراديس، واعترف أفراد التدفق الخلوي الأساسية في معهد كوخ، وموظفي مختبر التكنولوجيا مايكروسيستمز في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا بامتنان. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح EB011187 RC1-02، DE013023، DE016516، EB000351، وجزئيا من قبل المركز الوطني للسرطان معهد السرطان دعم (كور) المنح P30-CA14051 وMPP-09Call-انجر-60.
Materials
| Device Holder & Plastic reservoir | SQZ Biotechnologies | Holder | |
| LSRFortessa Analyzer | Becton Dickinson | N/A | Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities |
| Microfluidic device | SQZ Biotechnologies | Cell Squeeze | |
| O-Rings | McMaster | 9452K311 | |
| Pressure system to operate device | SQZ Biotechnologies | Pressure System | |
| Tweezers | |||
| Ultrasound bath |
References
- Schaffert, D., Wagner, E. Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems. Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-138 (2009).
- Leader, B., Baca, Q. J., Golan, D. E. Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 21-39 (2008).
- Kim, D., et al. Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells by Direct Delivery of Reprogramming Proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Dhar, S., Daniel, W. L., Giljohann, D. A., Mirkin, C. A., Lippard, S. J. Polyvalent Oligonucleotide Gold Nanoparticle Conjugates as Delivery Vehicles for Platinum(IV) Warheads. J. Am. Chem. Soc. 131, 14652-14653 (2009).
- Jiang, Z. -. X., Zhang, Z. -. Y. Targeting PTPs with small molecule inhibitors in cancer treatment. Cancer and Metastasis Reviews. 27, 263-272 (2008).
- Derfus, A. M., Chan, W. C. W., Bhatia, S. N. Intracellular Delivery of Quantum Dots for Live Cell Labeling and Organelle Tracking. Adv. Mater. 16, 961-966 (2004).
- Michalet, X., et al. Quantum Dots for Live Cells in Vivo Imaging, and Diagnostics. Science. 307, 538-544 (2005).
- Dahan, M., et al. Diffusion Dynamics of Glycine Receptors Revealed by Single-Quantum Dot Tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
- Slowing, I. I., Trewyn, B. G., Lin, V. S. Y. Mesoporous Silica Nanoparticles for Intracellular Delivery of Membrane-Impermeable Proteins. J. Am. Chem. Soc. 129, 8845-8849 (2007).
- Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 581-593 (2005).
- Joseph, Z. Cationic lipids used in gene transfer. Advanced Drug Delivery Reviews. 27 (97), 17-28 (1997).
- Verma, A., et al. Surface-structure-regulated cell-membrane penetration by monolayer-protected nanoparticles. Nat. Mater. 7, 588-595 (2008).
- Yan, M., et al. A novel intracellular protein delivery platform based on single-protein nanocapsules. Nat. Nano. 5, 48-53 (2010).
- Shi Kam, N. W., Jessop, T. C., Wender, P. A., Dai, H. Nanotube Molecular Transporters: Internalization of Carbon Nanotube-Protein Conjugates into Mammalian Cells. J. Am. Chem. Soc. 126, 6850-6851 (2004).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
- li, S. Electroporation Gene Therapy: New Developments In Vivo and In Vitro. Current Gene Therapy. 4, 309-316 (2004).
- Fox, M., et al. Electroporation of cells in microfluidic devices: a review. Anal. Bioanal. Chem. 385, 474-485 (2006).
- Miller, D. L., Pislaru, S. V., Greenleaf, J. F. Sonoporation: Mechanical DNA Delivery by Ultrasonic Cavitation. Somatic Cell and Molecular Genetics. 27, 115-134 (2002).
- Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 2082-2087 (2013).
- Lee, J., et al. Nonendocytic Delivery of Functional Engineered Nanoparticles into the Cytoplasm of Live Cells Using a Novel, High-Throughput Microfluidic Device. Nano Lett. 12, 6322-6327 (2012).
