Zellzusammendrücken als Robust, Mikrofluidik Intrazelluläre Delivery Platform
Summary
Schnelle mechanische Verformung von Zellen als vielversprechender, Vektor-freie Methode für intrazellulären Transport von Makromolekülen und Nanomaterialien entstanden. Dieses Protokoll bietet detaillierte Schritte auf, wie das System für eine breite Palette von Anwendungen.
Abstract
Schnelle mechanische Verformung von Zellen als vielversprechender, Vektor-freie Methode für intrazellulären Transport von Makromolekülen und Nanomaterialien entstanden. Diese Technologie hat bei der Bewältigung zuvor anspruchsvolle Anwendungen Potenzial gezeigt, einschließlich der Lieferung in primären Immunzellen, Zell Umprogrammierung, Kohlenstoff-Nanoröhrchen und Quantenpunkt-Lieferung. Dieser vektorfreien mikrofluidischen Plattform stützt sich auf mechanische Zerstörung der Zellmembran zu cytosolische Abgabe des Zielmaterials zu erleichtern. Hier beschreiben wir die detaillierte Verfahren für die Verwendung dieser Mikrofluidvorrichtungen einschließlich Vorrichtungsanordnung, Zellpräparation und den Systembetrieb. Dieser Liefer Ansatz erfordert eine kurze Optimierung von Gerätetyp und Betriebsbedingungen für die zuvor gemeldet Anwendungen. Die Anweisungen gelten verallgemeinerbar zu den meisten Zelltypen und Liefer Materialien wie dieses System nicht spezialisierten Puffer oder chemische Modifikation / Konjugation Schritte erfordern. Diese Arbeiten stellen auchs Empfehlungen, wie die Geräteleistung zu verbessern und störungs schießen mögliche Probleme zu Verstopfung, geringe Liefer Effizienz und die Lebensfähigkeit der Zellen zusammen.
Introduction
Freisetzung von Makromolekülen in die Zelle Zytoplasma ist ein kritischer Schritt in der therapeutischen und Forschungsanwendungen. Nanopartikel-vermittelte Abgabe, zum Beispiel, hat Potenzial in der Gentherapie 1,2 gezeigt, während Protein-Lieferung ist ein vielversprechendes Mittel beeinflussen die Zellfunktion sowohl in klinischen und Labor 3 4 Einstellungen. Andere Materialien, wie zum Beispiel Medikamente aus kleinen Molekülen, Quantenpunkte oder Gold-Nanopartikel, sind von Interesse in Anwendungen von Krebstherapeutika 5,6 bis 7,8 intrazelluläre Markierung und Einzelmolekül-Tracking-9.
Die Zellmembran weitgehend undurchlässig für Makromoleküle. Viele existierende Techniken verwenden, polymere Nanopartikel 10,11, Liposomen 12 oder chemische Modifikationen 13 bis Membran Störung oder endozytotische Lieferung zu erleichtern. Bei diesen Verfahren sind die Abgabeeffizienz und die Lebensfähigkeit der Zellen oft abhängig von der Struktur der the Zielmolekül und der Zelltyp. Diese Verfahren können bei der Lieferung von strukturell einheitlichen Materialien wie Nukleinsäuren effizient sein, aber für die Lieferung von mehr strukturell unterschiedlichen Materialien, wie Proteinen und 14,15 Nano 7 sind oft ungeeignet. Darüber hinaus ist der Mechanismus, der Endosomen Störung meisten dieser Verfahren beruhen auf häufig ineffizient vor, sodass viel Material in Vesikel-Strukturen 16 gefangen. Schließlich, Methoden, die oft für die Verwendung mit etablierten Zelllinien entwickelt, sind nicht gut zu übersetzen, um Primärzellen.
Membranporenbildung Methoden wie Elektroporation 17,18 Sonoporation und 19, sind eine attraktive Alternative in einigen Anwendungen, jedoch sind sie bekannt, die Lebensfähigkeit der Zellen gering verursachen und kann durch die Ladung der Ziel Lieferung Material begrenzt werden.
Schnelle mechanische Verformung von Zellen, einer mikrofluidischen Ansatz zur Lieferung, hat vor kurzem, EinzelhandelATED seine Vorteile gegenüber aktuellen Techniken im Rahmen der Neuprogrammierung Zelle 20 und 21 Nanomaterial Lieferung. Dieses Verfahren beruht auf mechanischen Störung o der Zellmembran zu cytosolische Abgabe von in der Umgebung vorhandenen Materialien Puffer erleichtern. Das System hat gezeigt, wodurch Potenzial in zuvor Herausforderung Zelltypen (zB primäre Immunzellen und Stammzellen) und Materialien (zB Antikörper und Kohlenstoffnanoröhren). Hierbei wird die allgemeine Vorgehensweise, um diese Geräte für intrazellulären Transport von Makromolekülen Ziel verwenden beschrieben. Das Verfahren ist verallgemeinerbar zu den meisten Zelltypen und Liefer Materialien, jedoch ist es empfehlenswert, dass man führen eine kurze Optimierung der Bedingungen, wie in unserem zuvor berichtet, Design-Richtlinien 20 beschrieben, für alle bisher nicht gemeldet Anwendungen. Bisher hat das System erfolgreich für die Lieferung von RNA-, DNA-, Gold-Nanopartikel, Quantenpunkte, Kohlenstoff-Nanoröhren, Protein verwendets und Dextran-Polymere 20,21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bestimmte Aspekte der beschriebenen experimentellen Verfahren (dh andere als Chip-Design-und Betriebsgeschwindigkeit Faktoren) müssen je nach Zellentyp und Freisetzungsmaterial das System angewendet wird, um optimiert werden. Die Adressen, die folgt einige der häufigsten Faktoren, die bei der Gestaltung Experimente Diskussion.
Um die Liefersignal für fluoreszenzmarkierten Verbindungen zu verbessern, muss man zu den Quellen der Hintergrundfluoreszenz zu adressieren. Oberflächenbi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken T. Shatova für hilfreiche Diskussion über Versuchsplanung und Datenanalyse. Die Unterstützung und Know-how von G. Paradis, werden die Mitarbeiter der Durchflusszytometrie Kern an der Koch-Institut und das Personal der Mikrosystemtechnik-Labor am Massachusetts Institute of Technology dankbar anerkannt. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grants RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351 unterstützt und teilweise von der National Cancer Institute Cancer Center Support (Core) Gewährt P30 CA14051-und MPP-09Call-Langer-60.
Materials
| Device Holder & Plastic reservoir | SQZ Biotechnologies | Holder | |
| LSRFortessa Analyzer | Becton Dickinson | N/A | Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities |
| Microfluidic device | SQZ Biotechnologies | Cell Squeeze | |
| O-Rings | McMaster | 9452K311 | |
| Pressure system to operate device | SQZ Biotechnologies | Pressure System | |
| Tweezers | |||
| Ultrasound bath |
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