एक मजबूत, microfluidic intracellular वितरण मंच के रूप में सेल फैलाएंगे
Summary
कोशिकाओं का तेजी से यांत्रिक विरूपण बड़े अणुओं और nanomaterials के intracellular वितरण के लिए एक होनहार, वेक्टर मुक्त विधि के रूप में उभरा है. इस प्रोटोकॉल आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए इस प्रणाली का उपयोग करने के बारे में विस्तृत कदम प्रदान करता है.
Abstract
कोशिकाओं का तेजी से यांत्रिक विरूपण बड़े अणुओं और nanomaterials के intracellular वितरण के लिए एक होनहार, वेक्टर मुक्त विधि के रूप में उभरा है. यह तकनीक पहले से चुनौतीपूर्ण आवेदन के समाधान में संभावित दिखाया गया है;, सहित प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं, सेल reprogramming, कार्बन नैनोट्यूब, और क्वांटम डॉट वितरण के लिए वितरण. इस वेक्टर मुक्त microfluidic मंच लक्ष्य सामग्री की साइटोसोलिक प्रसव की सुविधा के लिए कोशिका झिल्ली के यांत्रिक विघटन पर निर्भर करता है. इस के साथ साथ, हम डिवाइस विधानसभा, सेल तैयारी, और सिस्टम ऑपरेशन, सहित इन microfluidic उपकरणों के लिए उपयोग की विस्तृत विधि का वर्णन. इस वितरण दृष्टिकोण डिवाइस प्रकार और पहले से unreported अनुप्रयोगों के लिए परिचालन की स्थिति का एक संक्षिप्त अनुकूलन की आवश्यकता है. इस प्रणाली विशेष बफ़र्स या रासायनिक संशोधन / संयुग्मन कदम की आवश्यकता नहीं है के रूप में दिए गए निर्देशों का सबसे प्रकार की कोशिकाओं और वितरण सामग्री को generalizable हैं. यह काम भी प्रदानडिवाइस के प्रदर्शन में सुधार और clogging, कम प्रसव क्षमता, और सेल व्यवहार्यता से संबंधित संभावित मुद्दों परेशानी से शूट करने के लिए पर सिफारिशें की हैं.
Introduction
सेल cytoplasm के लिए बड़े अणुओं की डिलिवरी चिकित्सकीय और अनुसंधान अनुप्रयोगों में एक महत्वपूर्ण कदम है. प्रोटीन वितरण नैदानिक 3 और प्रयोगशाला दोनों 4 सेटिंग्स में सेलुलर समारोह को प्रभावित करने का एक होनहार साधन है, जबकि nanoparticle मध्यस्थता वितरण, उदाहरण के लिए, जीन थेरेपी 1,2 में संभावित दिखाया गया है. इस तरह के छोटे अणु दवाओं, क्वांटम डॉट्स, या सोने के नैनोकणों रूप में अन्य सामग्री, 5,6 कैंसर चिकित्सा से 9 ट्रैकिंग intracellular लेबलिंग 7,8, और एक अणु को लेकर आवेदन में रुचि के हैं.
कोशिका झिल्ली अणुओं को काफी हद तक अभेद्य है. कई मौजूदा तकनीक झिल्ली विघटन या endocytotic प्रसव की सुविधा के लिए polymeric नैनोकणों 10,11, liposomes 12, या रासायनिक संशोधनों 13 का उपयोग करें. इन तरीकों में, वितरण दक्षता और सेल व्यवहार्यता वीं की संरचना पर अक्सर निर्भर कर रहे हैंई लक्ष्य अणु और सेल प्रकार. इन विधियों ऐसे न्यूक्लिक एसिड के रूप में structurally समान सामग्री के वितरण में कुशल हो सकता है, लेकिन अक्सर इस तरह के प्रोटीन 14,15 और nanomaterials के रूप में 7 अधिक संरचनात्मक रूप से विविध सामग्री के वितरण के लिए बीमार उपयुक्त हैं. इसके अलावा, इन तरीकों में से अधिकांश पर भरोसा करते हैं कि endosome विघटन तंत्र इसलिए पुटिका संरचनाओं 16 में फंस ज्यादा सामग्री छोड़ रहा है, अक्सर अक्षम है. अंत में, अक्सर स्थापित सेल लाइनों के साथ प्रयोग के लिए विकसित कर रहे हैं तरीकों कि प्राथमिक कोशिकाओं को अच्छी तरह से अनुवाद नहीं है.
ऐसे electroporation 17,18 और sonoporation 19 के रूप में झिल्ली poration तरीकों, कुछ अनुप्रयोगों में एक आकर्षक विकल्प हैं, लेकिन वे कम सेल व्यवहार्यता कारण जाना जाता है और लक्ष्य वितरण सामग्री के प्रभारी द्वारा सीमित किया जा सकता है.
कोशिकाओं का तेजी से यांत्रिक विरूपण, वितरण करने के लिए एक microfluidic दृष्टिकोण, हाल ही में है demonstrसेल reprogramming 20 और nanomaterial वितरण 21 के संदर्भ में वर्तमान तकनीकों पर अपने फायदे पैदा. इस विधि आसपास बफर में मौजूद सामग्री की साइटोसोलिक प्रसव की सुविधा के लिए कोशिका झिल्ली ओ यांत्रिक विघटन पर निर्भर करता है. सिस्टम पहले से प्रकार की कोशिकाओं को चुनौती देने (जैसे प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं और स्टेम सेल) और सामग्री (जैसे एंटीबॉडी और कार्बन नैनोट्यूब) में संभावित सक्षम करने का प्रदर्शन किया है. इस के साथ साथ, लक्ष्य अणुओं के intracellular प्रसव के लिए इन उपकरणों का उपयोग करने के लिए सामान्य प्रक्रिया का वर्णन किया है. हालांकि, यह किसी भी पहले से unreported अनुप्रयोगों के लिए, हमारे पहले की रिपोर्ट डिजाइन दिशानिर्देश 20 में विस्तृत रूप में एक, स्थितियों की एक संक्षिप्त अनुकूलन आचरण की सिफारिश की है, प्रक्रिया सबसे प्रकार की कोशिकाओं और वितरण सामग्री को generalizable है. तिथि करने के लिए, सिस्टम शाही सेना डीएनए, सोने के नैनोकणों, क्वांटम डॉट्स, कार्बन नैनोट्यूब, प्रोटीन की डिलीवरी के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया हैएस, और dextran पॉलिमर 20,21.
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रिया (चिप डिजाइन और संचालन की गति के अलावा अन्य यानी कारकों) के कुछ पहलुओं प्रणाली को लागू किया जाता है सेल प्रकार और वितरण सामग्री के आधार पर अनुकूलित किया जाना पड़ सकता है….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम प्रयोगात्मक डिजाइन और डेटा विश्लेषण पर उपयोगी चर्चा के लिए टी. Shatova धन्यवाद. जी पैराडिस की सहायता और विशेषज्ञता, मैसाचुसेट्स इंस्टीट्यूट ऑफ टेक्नोलॉजी में कॉख संस्थान में मूल प्रवाह cytometry, और माइक्रोसिस्टम्स प्रौद्योगिकी प्रयोगशाला के कर्मचारियों के कर्मियों को कृतज्ञता से स्वीकार कर रहे हैं. इस काम के स्वास्थ्य अनुदान RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351 के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित है, और आंशिक रूप से राष्ट्रीय कैंसर संस्थान कैंसर केंद्र सहायता (कोर) द्वारा P30-CA14051 और एमपीपी-09Call-लैंगर-60 अनुदान दिया गया था.
Materials
| Device Holder & Plastic reservoir | SQZ Biotechnologies | Holder | |
| LSRFortessa Analyzer | Becton Dickinson | N/A | Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities |
| Microfluidic device | SQZ Biotechnologies | Cell Squeeze | |
| O-Rings | McMaster | 9452K311 | |
| Pressure system to operate device | SQZ Biotechnologies | Pressure System | |
| Tweezers | |||
| Ultrasound bath |
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