Cell klemme som en robust, Microfluidic Intracellulær Levering Platform
Summary
Rapid mekanisk deformasjon av celler har dukket opp som en lovende, vektor-fri metode for intracellulær levering av makromolekyler og nanomaterialer. Denne protokollen gir detaljert fremgangsmåte på hvordan å bruke systemet for et bredt spekter av applikasjoner.
Abstract
Rapid mekanisk deformasjon av celler har dukket opp som en lovende, vektor-fri metode for intracellulær levering av makromolekyler og nanomaterialer. Denne teknologien har vist potensial i å ta opp tidligere utfordrende bruksområder, inkludert, levering til primære immunceller, celle omprogrammering, karbon nanorør, og quantum dot levering. Dette vektor-frie microfluidic plattform er avhengig av mekaniske forstyrrelser i cellemembranen for å lette cytosoliske levering av målet materiale. Heri beskriver vi detaljert metode for bruk for disse microfluidic enheter, inkludert, enhet montering, celleforberedelsen, og systemdrift. Denne leveransen tilnærming krever en kort optimalisering av enhetstype og driftsforhold for tidligere urapportert applikasjoner. De følger instruksjonene er generalizable til de fleste celletyper og leverings materialer som dette systemet ikke krever spesialiserte buffere eller kjemisk modifisering / konjugering trinn. Dette arbeidet gir ogsås anbefalinger om hvordan du kan forbedre enhetens ytelse og problemfri skyte potensielle problemstillinger knyttet til tilstopping, lave leverings effektivitet, og celle levedyktighet.
Introduction
Levering av makromolekyler i cellen cytoplasma er et kritisk punkt i terapeutiske og forskning. Nanopartikkel mediert levering, for eksempel, har vist potensial i genterapi 1,2, mens protein levering er et lovende middel for å påvirke cellulær funksjon i både kliniske og laboratorie-3 4 innstillinger. Andre materialer, for eksempel små molekyl narkotika, kvanteprikker, eller gull nanopartikler, er av interesse for applikasjoner som spenner fra kreftbehandling 5,6 til intracellulær merking 7,8, og eneste molekyl sporing ni.
Cellemembranen er stort sett ugjennomtrengelig for makromolekyler. Mange eksisterende teknikker bruke polymere nanopartikler 10,11, liposomer 12, eller kjemiske modifikasjoner 13 for å lette membran avbrudd eller endocytotic levering. I disse metodene, leveringseffektiviteten og cellelevedyktigheten er ofte avhengig av strukturen av the målmolekylet og den celletypen. Disse fremgangsmåter kan være effektive ved levering av strukturelt like materialer, slik som nukleinsyrer, men er ofte dårlig egnet for levering av mer strukturelt forskjellige materialer, slik som proteiner og 14,15 nano 7. Videre er endosome avbrudd mekanisme at de fleste av disse metodene er avhengige ofte ineffektiv, og dermed forlate mye materiale fanget i vesikkel strukturer 16. Endelig gjør fremgangsmåter som ofte er utviklet for bruk med etablerte cellelinjer ikke sette godt til primære celler.
Membran poration metoder, for eksempel elektroporering 17,18 og sonoporation 19, er et attraktivt alternativ i visse anvendelser, men de er kjent for å føre til lav celleviabilitet og kan være begrenset av den charge av målet leverings materiale.
Rapid mekanisk deformasjon av celler, en microfluidic tilnærming til levering, har nylig demonstrrerte sine fordeler fremfor dagens teknikker i sammenheng med celle omprogrammering 20 og nanomaterial levering 21. Denne metoden er avhengig av mekaniske forstyrrelser o cellemembranen for å lette cytosoliske levering av materialer som er tilstede i det omkringliggende buffer. Systemet har vist slik at potensialet i tidligere utfordrende celletyper (f.eks primære immunceller og stamceller) og materialer (f.eks antistoffer og karbon nanorør). Heri er den generelle prosedyre for å bruke disse anordninger for intracellulær levering av mål-makromolekyler er beskrevet. Fremgangsmåten er generaliseres til de fleste celletyper og leverings materialet, er det imidlertid anbefalt at man gjennomfører en kort optimalisering av betingelser, som beskrevet i våre tidligere rapporterte utforming føringer 20, for eventuelle tidligere ikke-rapporterte anvendelser. Til dags dato, har systemet blitt brukt med hell for levering av RNA, DNA, gull nanopartikler, kvanteprikker, karbon nanorør, proteins, og dekstran polymerer 20,21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Visse aspekter av den beskrevne eksperimentelle prosedyre (dvs. andre enn chip utforming og driftshastighet faktorer) kan være nødvendig for å være optimalisert, avhengig av celletype og levering av materialer i systemet påføres. Diskusjonen som følger adressene noen av de vanligste faktorene for å vurdere når designe eksperimenter.
For å bedre leverings signal for fluorescensmerkede forbindelser, må man ta kilder bakgrunn fluorescens. Overflate binding og endocytose, for…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker T. Shatova for nyttig diskusjon om eksperimentell design og dataanalyse. Den bistand og ekspertise av G. Paradis, er personell av flowcytometri kjernen på Koch Institute, og de ansatte på Microsystems Technology Laboratory ved Massachusetts Institute of Technology takknemlig erkjent. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grants RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351, og delvis ved National Cancer Institute Cancer Center Support (Core) Grants P30-CA14051 og MPP-09Call-Langer-60.
Materials
| Device Holder & Plastic reservoir | SQZ Biotechnologies | Holder | |
| LSRFortessa Analyzer | Becton Dickinson | N/A | Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities |
| Microfluidic device | SQZ Biotechnologies | Cell Squeeze | |
| O-Rings | McMaster | 9452K311 | |
| Pressure system to operate device | SQZ Biotechnologies | Pressure System | |
| Tweezers | |||
| Ultrasound bath |
References
- Schaffert, D., Wagner, E. Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems. Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-138 (2009).
- Leader, B., Baca, Q. J., Golan, D. E. Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 21-39 (2008).
- Kim, D., et al. Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells by Direct Delivery of Reprogramming Proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Dhar, S., Daniel, W. L., Giljohann, D. A., Mirkin, C. A., Lippard, S. J. Polyvalent Oligonucleotide Gold Nanoparticle Conjugates as Delivery Vehicles for Platinum(IV) Warheads. J. Am. Chem. Soc. 131, 14652-14653 (2009).
- Jiang, Z. -. X., Zhang, Z. -. Y. Targeting PTPs with small molecule inhibitors in cancer treatment. Cancer and Metastasis Reviews. 27, 263-272 (2008).
- Derfus, A. M., Chan, W. C. W., Bhatia, S. N. Intracellular Delivery of Quantum Dots for Live Cell Labeling and Organelle Tracking. Adv. Mater. 16, 961-966 (2004).
- Michalet, X., et al. Quantum Dots for Live Cells in Vivo Imaging, and Diagnostics. Science. 307, 538-544 (2005).
- Dahan, M., et al. Diffusion Dynamics of Glycine Receptors Revealed by Single-Quantum Dot Tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
- Slowing, I. I., Trewyn, B. G., Lin, V. S. Y. Mesoporous Silica Nanoparticles for Intracellular Delivery of Membrane-Impermeable Proteins. J. Am. Chem. Soc. 129, 8845-8849 (2007).
- Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 581-593 (2005).
- Joseph, Z. Cationic lipids used in gene transfer. Advanced Drug Delivery Reviews. 27 (97), 17-28 (1997).
- Verma, A., et al. Surface-structure-regulated cell-membrane penetration by monolayer-protected nanoparticles. Nat. Mater. 7, 588-595 (2008).
- Yan, M., et al. A novel intracellular protein delivery platform based on single-protein nanocapsules. Nat. Nano. 5, 48-53 (2010).
- Shi Kam, N. W., Jessop, T. C., Wender, P. A., Dai, H. Nanotube Molecular Transporters: Internalization of Carbon Nanotube-Protein Conjugates into Mammalian Cells. J. Am. Chem. Soc. 126, 6850-6851 (2004).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
- li, S. Electroporation Gene Therapy: New Developments In Vivo and In Vitro. Current Gene Therapy. 4, 309-316 (2004).
- Fox, M., et al. Electroporation of cells in microfluidic devices: a review. Anal. Bioanal. Chem. 385, 474-485 (2006).
- Miller, D. L., Pislaru, S. V., Greenleaf, J. F. Sonoporation: Mechanical DNA Delivery by Ultrasonic Cavitation. Somatic Cell and Molecular Genetics. 27, 115-134 (2002).
- Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 2082-2087 (2013).
- Lee, J., et al. Nonendocytic Delivery of Functional Engineered Nanoparticles into the Cytoplasm of Live Cells Using a Novel, High-Throughput Microfluidic Device. Nano Lett. 12, 6322-6327 (2012).
