Сотовый Сжатие как Robust, микрофлюидных внутриклеточного Delivery Platform
Summary
Быстрое механическая деформация клеток стала перспективный, векторные без метода внутриклеточной доставки макромолекул и наноматериалов. Этот протокол содержит подробные шаги, как использовать систему для широкого спектра приложений.
Abstract
Быстрое механическая деформация клеток стала перспективный, векторные без метода внутриклеточной доставки макромолекул и наноматериалов. Эта технология потенциал показано в решении ранее сложных приложений; включая, доставка в первичных иммунных клеток, перепрограммирования клеток, углеродной нанотрубки, и квантовой поставки точка. Этот вектор свободной Микрожидкостных платформа опирается на механическое разрушение клеточной мембраны, чтобы облегчить доставку цитозольного материала мишени. Здесь мы описываем подробную метод использования для этих микрофлюидных устройств, включая, сборки устройства, клеточного препарата, и работы системы. Этот подход доставка требует краткого оптимизацию типа устройства и условий работы для ранее несообщаемого приложений. Приведенные инструкции распространены на большинстве типов клеток и материалов поставки так как эта система не требует специальных буферов или шаги химическая модификация / сопряжения. Эта работа также обеспечитьсек рекомендации о том, как улучшить производительность устройства и без проблем снимать потенциальные проблемы, связанные к засорению, низкой эффективности доставки и жизнеспособности клеток.
Introduction
Доставка макромолекул в цитоплазме клеток является важным шагом в лечебных и исследовательских приложений. Наночастиц опосредованной доставки, например, показал потенциал в генной терапии 1,2, в то время как доставка белок является перспективным средством влияя на клеточную функцию как клинические, так и лабораторные 3 4 настройки. Другие материалы, такие как низкомолекулярных препаратов, квантовых точек, или наночастиц золота, представляют интерес в приложениях, начиная от лечения рака 5,6 к внутриклеточной маркировки 7,8, и одной молекулы отслеживания 9.
Клеточной мембраны в значительной степени непроницаемой для макромолекул. Многие существующие методы используют полимерные наночастицы 10,11, липосомы 12 или химические модификации 13 для облегчения мембраны разрушение или эндоцитозного доставку. В этих методах, жизнеспособность эффективность доставки и клетки часто зависят от структуры гое молекула-мишень и тип клеток. Эти методы могут быть эффективными при доставке структурно однородных материалов, таких как нуклеиновые кислоты, но часто плохо подходит для доставки более структурно различных материалов, таких как белки и наноматериалов 14,15 7. Кроме того, разрушение эндосомы механизм, что большинство из этих методов полагаться на зачастую является неэффективным, следовательно оставляя много материала в ловушке пузырьков структур 16. Наконец, методы, которые часто разработанные для использования с установленными клеточных линий не очень хорошо переводятся в первичных клеток.
Способы мембранной порации, такие как электропорации 17,18 и 19 sonoporation, являются привлекательной альтернативой в некоторых применений, однако они, как известно, вызывает низкий уровень жизнеспособности клеток и может быть ограничено расхода материала мишени доставки.
Быстрое механическая деформация клеток, микрофлюидных подход к поставке, недавно demonstrованные свои преимущества по сравнению с современными методами в контексте перепрограммирования клеток 20 и доставки наноматериалов 21. Этот метод основан на механическое разрушение о клеточной мембране, чтобы облегчить доставку цитозольного материалов, присутствующих в окружающей буфера. Система продемонстрировала позволяя потенциал в ранее вызов типов клеток (например, первичные иммунные клетки и стволовые клетки) и материалы (например, антитела и углеродных нанотрубок). При этом общий порядок, чтобы использовать эти устройства для внутриклеточной доставки целевых макромолекул описывается. Процедура распространены на большинстве типов клеток и материалов доставки, однако, рекомендуется, чтобы один проводить кратко оптимизацию условий, как подробно в наших ранее описанной конструкции принципов 20, для любых ранее незарегистрированных приложений. На сегодняшний день, система была успешно использована для доставки РНК, ДНК, наночастиц золота, квантовых точек, углеродных нанотрубок, белкас, а декстран полимеры 20,21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Некоторые аспекты описанной экспериментальной процедурой (т.е. отличной от микросхем и рабочей скорости факторы), возможно, должны быть оптимизированы в зависимости от типа клеток и доставки материала система применяется. В последующем обсуждении рассматриваются некоторые из на…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Т. Шатова за полезные обсуждения экспериментального проектирования и анализа данных. Помощь и экспертиза Г. Паради, личный состав проточной цитометрии ядра на Коха, и сотрудники технической лаборатории микросистем Массачусетского технологического института с благодарностью. Эта работа была поддержана Национальными Институтами Здоровья грантов RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351, и частично Национальный институт рака онкологический центр поддержки (ядро) Гранты Р30-CA14051 и MPP-09Call-Лангер-60.
Materials
| Device Holder & Plastic reservoir | SQZ Biotechnologies | Holder | |
| LSRFortessa Analyzer | Becton Dickinson | N/A | Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities |
| Microfluidic device | SQZ Biotechnologies | Cell Squeeze | |
| O-Rings | McMaster | 9452K311 | |
| Pressure system to operate device | SQZ Biotechnologies | Pressure System | |
| Tweezers | |||
| Ultrasound bath |
References
- Schaffert, D., Wagner, E. Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems. Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-138 (2009).
- Leader, B., Baca, Q. J., Golan, D. E. Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 21-39 (2008).
- Kim, D., et al. Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells by Direct Delivery of Reprogramming Proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Dhar, S., Daniel, W. L., Giljohann, D. A., Mirkin, C. A., Lippard, S. J. Polyvalent Oligonucleotide Gold Nanoparticle Conjugates as Delivery Vehicles for Platinum(IV) Warheads. J. Am. Chem. Soc. 131, 14652-14653 (2009).
- Jiang, Z. -. X., Zhang, Z. -. Y. Targeting PTPs with small molecule inhibitors in cancer treatment. Cancer and Metastasis Reviews. 27, 263-272 (2008).
- Derfus, A. M., Chan, W. C. W., Bhatia, S. N. Intracellular Delivery of Quantum Dots for Live Cell Labeling and Organelle Tracking. Adv. Mater. 16, 961-966 (2004).
- Michalet, X., et al. Quantum Dots for Live Cells in Vivo Imaging, and Diagnostics. Science. 307, 538-544 (2005).
- Dahan, M., et al. Diffusion Dynamics of Glycine Receptors Revealed by Single-Quantum Dot Tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
- Slowing, I. I., Trewyn, B. G., Lin, V. S. Y. Mesoporous Silica Nanoparticles for Intracellular Delivery of Membrane-Impermeable Proteins. J. Am. Chem. Soc. 129, 8845-8849 (2007).
- Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 581-593 (2005).
- Joseph, Z. Cationic lipids used in gene transfer. Advanced Drug Delivery Reviews. 27 (97), 17-28 (1997).
- Verma, A., et al. Surface-structure-regulated cell-membrane penetration by monolayer-protected nanoparticles. Nat. Mater. 7, 588-595 (2008).
- Yan, M., et al. A novel intracellular protein delivery platform based on single-protein nanocapsules. Nat. Nano. 5, 48-53 (2010).
- Shi Kam, N. W., Jessop, T. C., Wender, P. A., Dai, H. Nanotube Molecular Transporters: Internalization of Carbon Nanotube-Protein Conjugates into Mammalian Cells. J. Am. Chem. Soc. 126, 6850-6851 (2004).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
- li, S. Electroporation Gene Therapy: New Developments In Vivo and In Vitro. Current Gene Therapy. 4, 309-316 (2004).
- Fox, M., et al. Electroporation of cells in microfluidic devices: a review. Anal. Bioanal. Chem. 385, 474-485 (2006).
- Miller, D. L., Pislaru, S. V., Greenleaf, J. F. Sonoporation: Mechanical DNA Delivery by Ultrasonic Cavitation. Somatic Cell and Molecular Genetics. 27, 115-134 (2002).
- Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 2082-2087 (2013).
- Lee, J., et al. Nonendocytic Delivery of Functional Engineered Nanoparticles into the Cytoplasm of Live Cells Using a Novel, High-Throughput Microfluidic Device. Nano Lett. 12, 6322-6327 (2012).
