ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית
Summary
אנו מתארים את גישות ההדמיה אנו משתמשים כדי לחקור את ההפצה וניידות של חלבוני ניאון transfected תושב בreticulum endoplasmic (ER) באמצעות confocal ההדמיה של תאי חיים. אנחנו גם ultrastructurally לנתח את ההשפעה של הביטוי שלהם על הארכיטקטורה של תא subcellular זה.
Abstract
השומנים והחלבונים בתאי אוקריוטים הם החליפו ברציפות בין תאי תאים, אם כי אלה לשמור על ההרכב הייחודי שלהם ופונקציות למרות תנועת interorganelle המולקולרית האינטנסיבית. הטכניקות מתוארות במאמר זה הן אמצעי רב עוצמה של לימוד חלבון וניידות שומנים בדם וסחר in vivo ו בסביבה הפיזיולוגית שלהם. התאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) וירידה בקרינה בphotobleaching (פליפ) נמצאת בשימוש נרחב בטכניקות הדמיה לחיות תאים ללימוד סחר תאיים באמצעות מסלול Exo-endocytic,, לוקליזציה היווצרות של קומפלקסי חלבונים, והחלבונים ההמשכיות בין האברונים או subcompartments בmicrodomains שומנים בדם, אשר כולם יכולים להיות שנצפו בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. המגבלות של גישות אלו הן בעיקר כתוצאה מהשימוש בחלבוני היתוך ניאון, והחסרונות הפוטנציאליים שלהם כוללים artifactual מעל מפורשיון בתאים ואת האפשרות של הבדלים בקיפול והלוקליזציה של חלבונים מתויגים וילידים. לבסוף, כגבול של רזולוציה של מיקרוסקופיה אופטית (כ 200 ננומטר) אינו מאפשר חקירה של המבנה העדין של ER או subcompartments הספציפי שיכול לנבוע בתאים תחת לחץ (כלומר חוסר חמצן, מתן תרופה, ביטוי יתר של הטרנסממברני חלבוני תושב ER) או תחת מצבים פתולוגיים, אנו משלבים הדמיה לחיות תאים של תאי transfected תרבותיים עם ultrastructural ניתוחים הבוסס על מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.
Introduction
גילוי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) וריאנטים הרפאים שלה, ופיתוח המקביל של מיקרוסקופ פלואורסצנטי של, נפתח אפיקים חדשים לחלוטין לחקירה של חלבון התנהגות בתאים. טכניקות כגון התאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) וירידה בקרינה בphotobleaching (פליפ), שהם אפשריים בגלל היכולת הפנימית של fluorophores לכבות הקרינה שלהם תחת תאורה אינטנסיבית, מבוססות על הדמיה לחיות תאי confocal והשימוש בtransfected חלבוני היתוך ניאון 1-3. הם נמצאים בשימוש נרחב כדי להעריך לא רק את הלוקליזציה של חלבונים, אלא גם הניידות שלהם והובלת ועי, אשר יכול לחשוף רמזים חשובים הנוגעים לתפקודם 4.
התכונה הייחודית של תאי אוקריוטים היא נוכחותם של תאים תאיים שיש לי קומפוזיציות שומנים וחלבונים ספציפיות. למרות האברונים הם בידוד ע פיזיאד, הם צריכים לתקשר אחד עם השני ולשתף את המרכיבים מולקולריים על מנת לשמור על הומאוסטזיס הסלולר. מסלול ההפרשה מבטיח שהחלבונים והשומנים מסונתזים בחדר המיון להגיע ליעד הסופי הנכון שבו הם מפעילים את תפקידם. יכולים גם להיות מחוברים אברונים תאיים על ידי אתרים ליצירת קשר דינמיים המאפשרים למולקולות (שומנים) שתוחלפנה ישירות בין תאים. יתר על כן, חלבונים רבים להתאספו במתחמי heteromeric גדולים או הקשורים למיני שומנים מסוימים (רפסודות שומנים בדם / microdomains) בכדי להפוך לפונקציונלי פעיל או להיות מועבר ליעדן הסופי. כל היבטים ביולוגיים אלה משפיעים באופן משמעותי את מאפייני הקינטית של חלבונים, ולכן ניתן לחקור כראוי באמצעות הטכניקות מתוארות להלן.
הקבוצה שלנו בשימוש נרחב FRAP ולהעיף בשילוב עם מיקרוסקופ אלקטרונים כדי ללמוד את הארכיטקטורה של חדר המיון ותת השונים שלהתחומים. חדר המיון הוא התחנה הראשונה של מסלול ההפרשה וממלא תפקיד מרכזי בחלבון ושומני מיון 5. זהו אברון דינמי מאוד משנה שברורה לשקף את תפקידיה הרבים ושונים (כלומר חלבון וביוסינתזה שומנים וסחר, קיפול חלבונים, Ca 2 + אחסון ולשחרר, וחילוף חומרי xenobiotic). עם זאת, למרות שהם מורפולוגית, מרחבית, ותפקודיים שונים, תחומים אלה הם רציפים אחד עם השני, והשפע היחסי שלהם יכול להיות שונה בתאים בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. ידוע ביותר ותחומים בדרך כלל במרחב נפרד מחדר המיון הם מעטפת הגרעין, וER החלק ומחוספס, עם זאת, אנחנו ואחרים הראינו כי יש מבני ER עם ארכיטקטורה משוכללת יותר וארגון תלת ממדים בסוגי תאים שונים ו רקמות בתנאים פיסיולוגיים שיכול גם להיגרם על ידי אמצעים של גירויים מלחיצים כגון היפוקסיה, סמיםממשל, או על הביטוי של חלבוני ER-תושב הטרנסממברני 2,6 (והפניות בו).
יש לנו גם לאחרונה הפגין את נוכחותם של מבנים כאלה במודלים של תא של מחלות אנושיות 1,7. מקורם cisternae המוערמות של ER חלק, הם קבלו את השם הקולקטיבי של reticulum המאורגן החלק endoplasmic (Oser) ב2003 6, למרות שהם ידועים גם בשם karmellae, lamellae, וER גבישן על בסיס הארכיטקטורה שלהם, אשר, כמוהם גודל, יכול להשתנות. אחרי התאים transfected עם GFP התמזגו לאזור cytosolic של חלבונים (ת"א) ER-תושב (ד EGFP-ER) מעוגני זנב, הנטייה החלשה dimerizing של ה-GFP בטרנס באופן דרמטי משנה את הארגון ומבנה של חדר המיון. FRAP והניסויים FLIP הראו כי EGFP-ER ד הוא בחינם כדי לפזר בתוך OSERs, והעובדה שהוא נע מחדר מיון רשתי לOser ולהיפך </ Em> מצביע על כך שהמצרפים הם רציפים עם ER הרשתית שמסביב. ניתוח Ultrastructural אפשר לנו לתאם את נתוני הקרינה עם תיאור מפורט של אדריכלות Oser וארגון ברמת ננו: OSERs תמיד בנוי מערמות של cisternae לזווג של ER החלק אבל ייתכן שיש לי צורות שונות של ארגון המרחבי, כגון מסודר באופן קבוע סינוסי מערכים או מערבולות, או מערכים צינורי משושה "גבישן". שחלופים אלה להוביל למורפולוגיות מעוקב 8 אשר, כפי שהם כבר נמצאים בתאים בתנאים פיסיולוגיים 9 ולחצים כגון היפוקסיה 10, טיפול תרופתי 11, וסרטן 9 הבאים, ייתכן שיש פוטנציאל משמעותי כסמני ultrastructural.
לאחר הפגנה ראשונה זה באמצעות חלבוני GFP היתוך, השתמשנו ניסויי הדמיה כדי לנתח את ההתפשטות של תחומים ER בתגובה לטיפולים תרופתיים 12, assess הנטייה של חלבוני ניאון לoligomerise בתאי 13, וכדי לחקור את התפקיד של מוטציה, חלבון ת"א ALS צמוד להיווצרות של אגרגטים תאיים ממוצא ER שעשויה להיות רלוונטי ל1,8 פתוגניות שלה. היה מי שהציע כי היווצרות של אגרגטים תאיים (אשר מתרחשת במחלות ניווניות רבות 14) עשויה להיות מנגנון הגנה שנועד למנוע האינטראקציות בין חלבוני מוטציה רעילים ומרכיבי התא המקיפים 15.
להלן תיאור של שילוב של שיטות מיקרוסקופית אופטיות ואלקטרונים לחקירת מבנים בטרמינל C-שתחומים הידרופובי מוכנסים לתוך הקרום של ER, וניתוח של ההתנהגות הדינמית שלהם ואת ההשפעות של יתר הביטוי שלהם בתחום ER אדריכלות בתאים בתרבית (ראה תרשים 1 לתרשים זרימה של פרוטוקול הניסוי).
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקולים וגישות הדמיה מתוארות במאמר זה נעשו שימוש כדי לחקור את ההפצה וניידות של חלבוני ניאון ת"א transfected תושב בחדר המיון של תאי חיים. יש לנו גם ניתחתי את ההשפעה של ביטוי יתר של חלבונים אלה על הארכיטקטורה של תא subcellular זאת באמצעות ניתוחי ultrastructural.
<p class="jove_content" style="…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לFondazione Filarete לעזרתה ותמיכה בפרסום של מאמר זה. כמו כן, אנו רוצים להודות לCentro di Europeo Nanomedicina לשימוש במיקרוסקופ האלקטרונים הילוכים Tecnai G2.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) | Invitrogen | 41966029 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) w/o phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10270106 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine 200 mM solution | Invitrogen | 25030-024 | |
| jetPEI | Polyplus Transfection | PP10110 | |
| OxyFluor | Oxyrase Inc. | OF-0005 | |
| Glutaraldehyde Grade I | Sigma Aldrich | G5882 | |
| Sodium Cacodylate Trihydrate | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Osmium Tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Science | 19150 | |
| Uranyl Acetate dihydrate | Sigma Aldrich | 73943 | slightly radioactive |
| Propylene Oxide | Sigma-Aldrich | 82320 | |
| EPON embedding medium kit | Sigma-Aldrich | 45359-1EA-F | |
| Lead Citrate | Electron Microscopy Science | 17800 | |
| Bench top centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Spectral Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CO2 Microscope Cage Incubation System | OkoLab | ||
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 ° | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G2 | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc | ||
| steel culture cell chamber for 24 mm coverslip | Bioscience Tools | CSC-25 | |
| Electron Microscopy grids | Electron Microscopy Science | G300Cu |
References
- Fasana, E., et al. A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum. FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).
- Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux. Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).
- Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum. J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).
- Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. Bi-directional protein transport between the ER and. 20, 87-123 (2004).
- Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).
- Papiani, G., et al. Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome. J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).
- Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization. J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).
- Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. The dynamic ER: experimental approaches and current questions. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).
- Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells. Neuron. 12, 327-342 (1994).
- Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital. Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).
- Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells. J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13, 643-649 (2012).
- Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres. J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic proteins in neurodegenerative disease. Science. 296, 1991-1995 (2002).
- Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases. EMBO J. 27, 336-349 (2008).
- Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways. Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).
- Michida, T., et al. Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats. Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).
