Retrograd Mærkning af retina-ganglieceller i Voksen Zebrafisk med fluorescerende farvestoffer

Summary

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Abstract

Som retrograd mærkning af retinale ganglieceller (rGCS) kan isolere rGCS somata fra at dø sites, er det blevet den gyldne standard for at tælle rGCS i rGCS overlevelse og regeneration eksperimenter. Mange undersøgelser er blevet udført på pattedyr at forske rGCS overlevelse efter synsnerven skade. Men er endnu ikke blevet rapporteret om retrograd mærkning af rGCS i voksen zebrafisk, selvom nogle alternative metoder kan tælle celletal i retina ganglion cellelag (RGCL). I betragtning af den lille størrelse af den voksne zebrafisk kraniet og den store risiko for død efter boring på kraniet, vi åbner kraniet ved hjælp af syre-ætsning og forsegle hullet med en lyshærdende obligation, som i væsentlig grad kunne forbedre overlevelsen. Efter at absorbere farvestoffer i 5 dage, er næsten alle rGCS mærkes. Da denne metode ikke behøver at transektere synsnerven, er uerstattelig i forskning af rGCS overlevelse efter synsnerven crush i voksen zebrafisk. Her introducerer videnne metode trin for trin og giver repræsentative resultater.

Introduction

Som voksen zebrafisk har en stærk evne til at regenerere axoner efter optisk nerveskade ^1, en ​​passende metode til at tælle hele rGCS er vigtigt at evaluere rGCS overlevelse og regeneration ^2. Baseret på metoder til retrograde mærkningsordninger rGCS i pattedyr og guldfisk ^{3 – 5,} vi bygget den metode til at mærke rGCS fra tectum i voksen zebrafisk. For voksne zebrafisk, bør to kritiske tekniske problemer bemærkes: kraniet af voksne zebrafisk er meget lille ^6; de lever i et vandmiljø. Her behandler vi kraniet med ætsemidlet som minimerer de farer forbundet med boring ^5. Så vi forsegle hullet med lyshærdende binding, der forbedrer dyrs overlevelse efter kirurgi.

Tidligere blev flere andre teknikker vedtaget at tælle rGCS nummer på indirekte måder. HE farvning i nethinden sektioner etiketter alle typer af celler i RGCL ^7. Antistof mærkning i hele retina, såsom ø-1, kan også mærke amacrine celler ^8. Selvom retrograd etiket fra synsnerven stumpen kan mærke alle rGCS i nethinden, kan det ikke blive vedtaget i crush model, fordi det medfører ekstra skade på synsnerven. Drage fordel af retrograd etiket fra tectum, har vi forsket rGCS overlevelse og regeneration i synsnerven crush. Resultaterne viser, at næsten alle rGCS overlevede og over 90% af rGCS regenereret til tectum på den første uge i knuse-modellen ^9.

For at kunne mærke alle rGCS blev Dil pasta valgt efter sammenligning med flere andre kommercielle farvestoffer ^10. For det første er det specielt designet til in vivo væv mærkning. For det andet er en lipofil farvestof, som ikke kan diffundere i vand. Derudover kan denne fluorescens vare ved i lang tid, hvilket gør det en glimrende kandidat til rGCS overlevelse forskning.

Protocol

1.. Konstruer Kirurgi Apparatus BEMÆRK: For at sikre fiskene er i live under og efter operationen, drop anæstesi løsning ethyl-3-aminobenzoat methanesulfonate (MS-222, eller tricaine) ved en halv koncentration (0,015%) med en hastighed på 1 dråbe / sek gennem fiskens mund ved hjælp af en homebuilt drop, der er vist i figur 1. Lav en kasse, som vist i figur 1A (længde er 28 cm, bredde 10 cm, højde er 5 cm), sætte en svamp (længde er 6 cm,…

Representative Results

Som figur 4B-D show, antallet af DII +-celler er to tredjedele af DAPI +-celler i RGCL. I en normal retina, en montage billede af hele retina (Figur 4E) viser, at DII + rGCS er fordelt over hele nethinden, men i en regenereret nethinden (fig. 4F), som rGCS i det centrale område ikke regenereres til deres mål på den første uge, kunne de ikke mærkes. <img alt="Figur 1" …

Discussion

Retrograd mærkning af rGCS er vigtigt at forske rGCS overlevelse i pattedyr, men det har ikke været anvendt i zebrafisk. De alternative metoder, HE farvning ⁷ og antistoffarvning ^8, er ikke guld standarder for optælling rGCS nummer, og transgene linjer med alle rGCS mærket endnu ikke er blevet bygget ^{12, 13.} I denne video introducerer vi en metode til at retrograd label rGCS i nethinden af ​​voksne zebrafisk. Selvom omkring 1% af axoner rage lugtekolben eller andre områder ^…

Materials

MS222	Sigma Aldrich	E10521	USA
DiI	Invitrogen	N22880	USA
lightcuring bond	Heraeus Kulzer	Durafill bond	Germany
Gluma Etch	Heraeus Kulzer	Gluma Etch 35 Gel	Germany
Blue LED	Shenruo Medical Equipment Co.	Power Blue Light Curing Unit	China