Retrograde Markierung von retinalen Ganglienzellen im erwachsenen Zebrafisch mit Fluoreszenzfarbstoffen
Summary
We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.
Abstract
Als retrograde Markierung retinalen Ganglienzellen (RGC) kann RGZ Somata von sterbenden Websites zu isolieren, hat sich der Goldstandard für die Zählung in RGZ RGZ Überleben und Regenerationsversuche. Viele Studien haben in Säugetieren durchgeführt, um RGZ Überleben nach Verletzung des Sehnervs zu erforschen. Allerdings hat retrograde Markierung von RGC in erwachsenen Zebrafisch noch nicht berichtet worden, obwohl einige alternative Methoden können Zellzahlen in retinalen Ganglienzellschichten (RGCL) zählen. In Anbetracht der geringen Größe des erwachsenen Zebrafisch Schädel und das hohe Risiko des Todes nach dem Bohren auf dem Schädel, öffnen wir den Schädel mit Hilfe von Säure-Ätz-und versiegeln das Loch mit einem lichthärtenden Bindung, die die Überlebensrate deutlich verbessern konnte. Nach Absorption der Farbstoffe für 5 Tage, sind fast alle markierten RGCs. Da diese Methode muss nicht den Sehnerv durchschneiden, ist es in der Forschung der RGZ Überleben unersetzlich nach Sehnerv verknallt in erwachsenen Zebrafisch. Hier stellen wirdieses Verfahren Schritt für Schritt und repräsentative Ergebnisse liefern.
Introduction
Wie erwachsenen Zebrafisch haben eine starke Fähigkeit zur Axone nach Verletzung des Sehnervs 1 regenerieren, eine geeignete Methode zu zählen, die ganze RGZ ist wichtig, um das Überleben und die Regeneration RGZ 2 auszuwerten. Basierend auf den Methoden der retrograde Markierung RGZ in Säugetier-und Goldfisch 3-5 konstruierten wir die Methode, um von der RGZ Tectum in erwachsenen Zebrafisch zu beschriften. Bei erwachsenen Zebrafisch, sollten zwei kritischen technischen Belange beachtet werden: der Schädel des erwachsenen Zebrafisch ist sehr klein, 6; sie leben in einer Wasserumgebung. Hier behandeln wir den Schädel mit Ätzmittel, die die Gefahren, die mit Bohrungen 5 zugeordnet minimiert. Dann haben wir das Loch versiegeln mit lichthärtenden Bindung, die das Überleben der Tiere nach der Operation verbessert.
Bisher wurden mehrere andere Techniken angenommen, um RGZ Nummer auf indirekte Weise zu zählen. HE-Färbung in der Retina Abschnitte Etiketten aller Arten von Zellen in der RGCL 7. Antikörpermarkierung in der ganzen retina wie Insel-1, können auch beschriften Amacrinzellen 8. Obwohl retrograde Label aus der Sehnerv Stumpf können alle RGZ in der Netzhaut zu kennzeichnen, kann er nicht in das Gedränge Modell übernommen werden, da sie bewirkt, dass zusätzliche Schädigung des Sehnervs. Unter Ausnutzung der retrograden Etikett von der Tectum haben wir RGZ Überleben und die Regeneration im Sehnerv verknallt erforscht. Die Ergebnisse zeigen, dass fast alle RGZ überlebt und über 90% der RGZ regeneriert, um der Tectum in der ersten Woche im Gedränge Modell 9.
Um alle RGZ erfolgreich zu kennzeichnen, wurde Dil Paste nach Vergleich mit mehreren anderen Handelsfarbstoffen 10 gewählt. Erstens ist es insbesondere für in vivo Gewebemarkierungs gestalten. Zweitens ist es ein lipophiler Farbstoff, der nicht in Wasser diffundieren kann. Zusätzlich kann diese Fluoreszenz für eine lange Zeit, die es zu einem hervorragenden Kandidaten für RGCs Überleben Forschung macht anhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Retrograde Markierung von RGCs ist wichtig, RGCs Überleben in Säugetieren zu erforschen, aber es war nicht in Zebrafisch verwendet. Die alternativen Methoden, HE-Färbung 7 und 8 Antikörper-Färbung, sind nicht Goldstandards zum Zählen RGZ Nummer und transgenen Linien mit allen RGZ markiert wurde noch nicht gebaut 12, 13 ist. In diesem Video stellen wir eine Methode, um Label RGZ in der Netzhaut des erwachsenen Zebrafisch rückläufig. Obwohl etwa 1% der Axone zu Riechkolben oder and…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This is supported by 973 MOST grant (Grant No. 2011CB504402, 2012CB947602), National Natural Science Foundation of China (Grant No. 91132724, U1332136) and the ‘Hundred Talents Project’ of Chinese Academy of Science. The protocol was approved by the Committee on the Ethics of Animal Experiments of the USTC (Permit Number: USTCACUC1103013).
Materials
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521 | USA |
| DiI | Invitrogen | N22880 | USA |
| lightcuring bond | Heraeus Kulzer | Durafill bond | Germany |
| Gluma Etch | Heraeus Kulzer | Gluma Etch 35 Gel | Germany |
| Blue LED | Shenruo Medical Equipment Co. | Power Blue Light Curing Unit | China |
References
- Wyatt, C., et al. Analysis of the astray/robo2 zebrafish mutant reveals that degenerating tracts do not provide strong guidance cues for regenerating optic axons. J Neurosci. 30, 13838-13849 (2010).
- Grieshaber, P., Lagreze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. J Neurosci Methods. 192, 233-239 (2010).
- Schwalb, J. M., et al. Two factors secreted by the goldfish optic nerve induce retinal ganglion cells to regenerate axons in culture. J Neurosci. 15, 5514-5525 (1995).
- Watanabe, M., Inukai, N., Fukuda, Y. Survival of retinal ganglion cells after transection of the optic nerve in adult cats: a quantitative study within two weeks. Vis Neurosci. 18, 137-145 (2001).
- Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. , (2008).
- Bakken, T. E., Stevens, C. F. Visual system scaling in teleost fish. J Comp Neurol. 520, 142-153 (2012).
- Zhou, L. X., Wang, Z. R. Changes in number and distribution of retinal ganglion cells after optic nerve crush in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 159-162 (2002).
- Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
- Zou, S., Tian, C., Ge, S., Hu, B. Neurogenesis of retinal ganglion cells is not essential to visual functional recovery after optic nerve injury in adult zebrafish. PLoS One. 8, (2013).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: a comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117, 167-172 (2002).
- Zou, S. Q., et al. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J Vis Exp. , (2010).
- Tokuoka, H., Yoshida, T., Matsuda, N., Mishina, M. Regulation by glycogen synthase kinase-3beta of the arborization field and maturation of retinotectal projection in zebrafish. J Neurosci. 22, 10324-10332 (2002).
- Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132, 2955-2967 (2005).
- Li, L., Dowling, J. E. Disruption of the olfactoretinal centrifugal pathway may relate to the visual system defect in night blindness b mutant zebrafish. Journal of Neuroscience. 20, 1883-1892 (2000).
- Kassing, V., Engelmann, J., Kurtz, R. Monitoring of Single-Cell Responses in the Optic Tectum of Adult Zebrafish with Dextran-Coupled Calcium Dyes Delivered via Local Electroporation. PLoS One. 8, (2013).
