Valutare Miogenica risposta e Vasoactivity nelle arterie di resistenza mesenteriche Utilizzando Myography Pressione

Summary

Myography pressione è utilizzato per valutare vasoactivity di piccole arterie che si sviluppano costrizione sostenuta quando sotto pressione. Questo manoscritto fornisce un protocollo dettagliato per valutare in segmenti isolati di piccole arterie mesenterici di ratto, vasoactivity e l'effetto della pressione intraluminale del diametro vascolare.

Abstract

Le piccole arterie di resistenza restringono e si dilatano rispettivamente in risposta ad un aumento o diminuzione della pressione endoluminale; questo fenomeno noto come risposta miogenico è un regolatore chiave di flusso ematico locale. In condizioni isobariche piccole arterie di resistenza sviluppano sostenuti costrizione noto come tono miogenico (MT), che è un importante determinante di resistenze vascolari sistemiche (SVR). Quindi, ex vivo preparazioni pressione di piccole arterie di resistenza sono i principali strumenti per studiare la funzione microvascolare negli stati vicini-fisiologico. Per ottenere questo, un segmento intatto fresco isolato di una piccola arteria resistenza (diametro ~ 260 micron) è montata su due cannule piccolo vetro e pressurizzato. Queste preparazioni arteriose conservano più a caratteristiche vivo e la valutazione permesso del tono vascolare in tempo reale. Qui forniamo un protocollo dettagliato per la valutazione vasoactivity in pressurizzati piccole arterie resistenza mesenterici di ratti; queste arterie sviluppanovasocostrizione sostenuta – circa il 25% del diametro massimo – quando sotto pressione a 70 mmHg. Queste preparazioni arteriose possono essere utilizzati per studiare l'effetto dei composti in fase di sperimentazione in relazione tra pressione intra-arteriosa e vasoactivity e determinare alterazioni della funzione microvascolare in modelli animali di varie malattie.

Introduction

Arterie piccola resistenza sono i principali determinanti di SVR e svolgono un ruolo importante nella fisiopatologia di molte malattie ^1,2. Condizioni come il diabete ^3, la gravidanza ^4, ischemia-riperfusione ^5, obesità e ipertensione ^6,7 sono spesso associati con la funzione microvascolare alterata. Myography vascolare può fornire non solo importanti conoscenze cambiamenti nella funzione microvascolare in varie malattie, ma anche aiutare a identificare target terapeutici e di valutare l'efficacia di composti vasoattivi. Funzione vascolare è stata studiata utilizzando isolate piccole arterie in condizioni di nave isometriche o isobariche ^8. Descrizione dettagliata di myography isometrica è fornito altrove ^9. Tuttavia ci sono differenze tra i dati ottenuti da isometrica contro preparazioni isobariche ^10-12. Poiché preparazioni arteriosi pressurizzati permettono lo studio della funzione microvascolare in condizioni pressoché fisiologiche, larisultati ottenuti possono correlare meglio con il comportamento in vivo del letto vascolare ^8,13.

Nel 1902 Bayliss descrisse per primo l'effetto della pressione transmurale del diametro vascolare ^14. Si osserva in piccole arterie di resistenza di vari distretti vascolari di conigli, cani e gatti che una diminuzione della pressione è stata seguita da vasodilatazione, e un aumento della pressione è stata seguita da vasocostrizione. Questo fenomeno è noto come risposta miogenico. Bayliss e gli investigatori successivi hanno osservato che in condizioni isobariche arterie piccola resistenza sviluppano costrizione sostenuta chiamato MT ^15,16. Sia risposta miogenica e MT possono essere valutati utilizzando myography pressione (PM) tecnica. PM viene utilizzato principalmente per determinare vasoactivity delle piccole arterie, vene e altre imbarcazioni. Oltre a valutare l'effetto dei composti vasoattivi sul diametro vascolare, PM – come indica il nome – viene utilizzato per valutare intravascolare ch-mediata pressioneanges del diametro vascolare. Nel corso degli ultimi decenni i progressi nel software per computer, che ha migliorato la microscopia video e pipetta di vetro tirando, hanno reso PM più facile da eseguire. Tuttavia, la dissezione di segmenti intatti vitali di piccoli vasi sanguigni rimane noiosa e talvolta impegnativo. Qui descriviamo un protocollo dettagliato per studiare la risposta miogenico nelle piccole arterie di resistenza mesenteriche isolati da ratti.

Protocol

Gli esempi qui riportati sono da esperimenti approvati dal IACUC presso la Georgia Regents University – Protocollo n: # 2011-0408 1. Preparazione dei reagenti Preparare la soluzione dissezione magazzino: per 500 ml di soluzione madre dissezione (5x), sciogliere 21,18 g NaCl, 0,875 g KCl, 0,739 g MgSO4, 1.049 g MOPS e 0.019 g di EDTA in 450 ml di acqua Milli-Q. Regolare il pH a 7,3-7,4 con 1 N NaOH. Portare al volume di 500 ml con acqua Milli-Q. Soluzione madre può esse…

Representative Results

Rappresentazione schematica di un miografo pressione tipico set-up è mostrata in Figura 1. Le due estremità del recipiente sono cannulati con una micropipetta di vetro e fissati con suture su entrambi i lati. Via tubo e un rubinetto aperto, una cannula viene collegato ad un regolatore di pressione servocomandato; l'altra cannula è collegata ad un rubinetto chiuso. La camera è perfuso con PSS e diametro vascolare cambiamenti sono osservati da un microscopio invertito collegato ad una telecamera C…

Discussion

Passaggi critici, risoluzione dei problemi e modifiche

In una preparazione tipica imbarcazione isobarica, l'arteria viene pressurizzato a 70 mmHg tra due cannule di vetro perfusi con acqua calda (37 ° C) PSS. Dopo 30-45 min, arterie sviluppano MT, caratterizzato dalla riduzione spontanea di diametro che stabilizza in 20-30 min. Le arterie di resistenza dai vari distretti vascolari sviluppano MT variabile. Per esempio resistenza ratto arterie mesenteriche sviluppano MT ~ 25% di PD, mentre l…

Materials

			Chemical
Acetylcholine	Sigma Aldrich	A6625
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	223506
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G5767
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA)	Sigma Aldrich	E3889
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	E9884
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma Aldrich	M7506
MOPS	Sigma Aldrich	M5162
Phenylephrine	Sigma Aldrich	P6126
Potassium chloride (KCl)	Sigma Aldrich	P3911
Potassium phosphate (KH2PO4)	Sigma Aldrich	P5655
Sodium bicarbonate (NaHCO3 )	Sigma Aldrich	S6014
Sodium chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	S7653
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	S5881
Sodium nitroprusside	Sigma Aldrich	13451
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4)	Sigma Aldrich	S9638
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P8574
			Table 1.
			Physiological salt solution (1000 ml) mM KCl 4.9 0.365 g NaCl 112 6.545 g MgSO4.7H2O 1.2 0.296 g KH2PO4 1.2 0.163 g Glucose 11.5 2.072 g NaHCO3 26 2.184 g HEPES 10 2.383 g CaCl2 2 2 ml (1M stock) De-ionized water 998 ml Ca2+ free physiological salt solution (100 ml) mM KCl 4.9 0.036 g NaCl 112 0.645 g MgSO4.7H2O 1.2 0.029 g KH2PO4 1.2 0.016 g Glucose 11.5 0.207 g NaHCO3 26 0.218 g HEPES 10 0.238 g EGTA 0.39 0.015 g Sodium nitroprusside 0.1 0.0026 g De-ionized water 100 ml Dissection solution, stock (500 ml) mM NaCl 145 21.18 g KCl 4.7 0.875 g MgSO4 1.2 0.739 g MOPS 2 1.049 g EDTA 0.02 0.019 g De-ionized water 500 ml Working dissection solution (100 ml) mM Dissection solution stock 20 ml Glucose 1.2 0.091 g NaH2PO4 5 0.016 g Sodium pyruvate 2 0.022 g CaCl2 2 0.2 ml (1M stock) De-ionized water 79.8 ml
			Table 2. Composition of Experimetnal solutions
			Equipment
CCD Monochrome Camera	The imaging Source	DMK 21AU04
Single inline solution heater	Warner Instruments	64-0102
Thermistor	Warner Instruments	64-0108
Dual automatic temperature controller	Warner Instruments	TC-344B
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instruments	P-97
Fluorescence System Interface	IonOptix	model FSI-700
Forceps and scissors	World Precision Instruments
Ion Wizard-Core and Analysis	IonOptix	Ion Wizard 6.0
Laboratory tubing	Silastic	508-005
Male Sprague Dawley rat	Harlan Laboratories
Master flex console drive	Cole-parmer
Milli-Q Plus Ultrapure Water System	Millipore	ZD5211584
Ophthalmic monofilament nylon suture	Ethicon	9007G
Photometry and Dimensioning Microscope	Motic	AE31
Pressure Servo Controller with peristaltic pump and pressure transducer	Living Systems Instrumentation	PS-200
Stereomicroscope	Nikon Instruments Inc	SMZ660
Vessel Chamber	Living Systems Instrumentation	CH-1
Dissection dish	Living Systems Instrumentation	DD-90-S
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW120-6
Microforge	Stoelting	51550
			Table 3.