Vurdere myogenic Response og vasoactivity I Resistance tarmens arterier Bruke Trykk Myography

Summary

Trykk myography brukes til å vurdere vasoactivity av små arterier som utvikler vedvarende innsnevring når trykk. Dette manuskriptet gir en detaljert protokoll for å vurdere i isolerte segmenter av små mesenteriske arterier fra rotte, vasoactivity og effekten av intraluminal press på vaskulær diameter.

Abstract

Liten motstand arterier seg sammen og utvider seg henholdsvis i respons til økt eller redusert intraluminale trykk; Dette fenomen kjent som myogenisk reaksjon er en viktig regulator for lokal blodstrøm. I isobariske betingelser liten motstand arterier utvikler vedvarende innsnevring kjent som myogenisk tone (MT), som er en viktig determinant for systemisk vaskulær resistens (SVR). Derfor ex vivo trykk preparater av små motstandsarterier er viktige verktøy for å studere mikrovaskulær funksjon i nær-fysiologiske tilstander. For å oppnå dette, er en nylig isolert intakt segment av en liten motstand arterie (diameter ~ 260 mikrometer) som er montert på to små glass kanyler og trykk. Disse arterielle forberedelser beholde mest in vivo egenskaper og tillatelse vurdering av vaskulær tone i sanntid. Her gir vi en detaljert protokoll for vurdering vasoactivity i trykk små motstand tarmens arterier fra rotter; disse arteriene utviklervedvarende vasokonstriksjon – ca 25% av maksimal diameter – når trykksatt til 70 mmHg. Disse arterielle preparater kan anvendes for å studere effekten av investigational forbindelser på forholdet mellom intra-arterielt trykk og vasoactivity og bestemme endringer i mikrovaskulær funksjon i dyremodeller av ulike sykdommer.

Introduction

Liten motstand arterier er viktige determinanter av SVR og spiller en viktig rolle i patofysiologien av mange sykdommer ^1,2. Tilstander som diabetes ^3, graviditet ^4, ischemi-reperfusjon ^5, fedme og høyt blodtrykk ^6,7 er ofte assosiert med endret mikrovaskulær funksjon. Vaskulær myography kan ikke bare gi viktig innsikt i endringer i mikrovaskulær funksjon i ulike sykdommer, men også bidra til å identifisere terapeutiske mål og evaluere effekten av vasoaktive forbindelser. Vaskulær funksjon har blitt undersøkt ved hjelp av isolerte små arterier henhold isometriske eller isobariske fartøyet forhold ^åtte. Detaljert beskrivelse av isometrisk myography er gitt andre steder ^ni. Men det er forskjeller i data innhentet fra isometrisk versus isobariske forberedelser ^10-12. Siden trykk arterielle preparater tillater studiet av mikrovaskulær funksjon i nær fysiologiske forhold,innhentet funn kan korrelere bedre med in vivo oppførselen til karseng ^8,13.

I 1902 Bayliss først beskrevet effekten av transmural press på vaskulær diameter ^14. Han observerte i liten motstand arterier fra forskjellige vaskulære sjikt av kaniner, katter og hunder som en reduksjon i trykk ble etterfulgt av vasodilatasjon, og en økning i trykket ble etterfulgt av vasokonstriksjon. Dette fenomenet er kjent som myogenic respons. Bayliss og påfølgende etterforskere observert at i isobariske forholdene liten motstand arterier utvikle vedvarende innsnevring kjent som MT ^15,16. Både myogenisk respons og MT kan vurderes ved hjelp av trykk myography (PM) teknikk. PM er først og fremst brukes til å bestemme vasoactivity av små arterier, vener og andre fartøy. I tillegg til å vurdere effekten av vasoaktive forbindelser på vaskulær diameter, PM – som navnet indikerer – brukes for å vurdere intravaskulære trykk-mediert changes på vaskulær diameter. I løpet av de siste tiårene fremskritt innen programvare, som forbedret videomikroskopi og glass pipette trekke, har gjort PM lettere å utføre. Men disseksjon av levedyktige intakte segmenter av små blodkar forblir kjedelig og noen ganger utfordrende. Her vil vi skissere en detaljert protokoll for å studere myogenic respons i små mesenteriske motstand arterier isolert fra rotter.

Protocol

Eksemplene vist her er fra eksperimenter godkjent av IACUC ved Georgia Regents University – protokoll: # 2011-0408 1. Utarbeidelse av reagenser Forbered disseksjon løsning lager: For 500 ml lager disseksjon løsning (5x), oppløse 21,18 g NaCl, 0,875 g KCl, 0,739 g MgSO4, 1,049 g MOPS og 0,019 g EDTA i 450 ml Milli-Q vann. Juster pH til 7,3 til 7,4 ved anvendelse av 1 N NaOH. Gjør opp volumet til 500 ml med Milli-Q vann. Stamløsning kan lagres opp til 7-10 dager. Se …

Representative Results

Skjematisk representasjon av et typisk trykk myograph oppsett er vist i figur 1. De to ender av beholderen er kanylert med et glass mikropipette og festes med sting på begge sider. Via slangen og en åpen stoppekran, er en kanyle koblet til en servostyrt trykkregulator; den andre kanyle er forbundet med en lukket stoppekran. Kammeret er perfunderes med PSS og vaskulær diametre blir observert av et invertert mikroskop koblet til et CCD-kamera. Den arterielle segment trykksa…

Discussion

Kritisk trinn, feilsøking og modifikasjoner

I et typisk fartøy isobar preparatet, blir arterien under trykk ved 70 mm Hg mellom to glass kanyler perfundert med varm (37 ° C) PSS. Etter 30-45 min, arterier utvikle MT, karakterisert ved spontan reduksjon i diameter som stabiliserer i 20-30 min. Motstands arterier fra ulike vaskulære senger utvikle variabel MT. For eksempel rotte motstand tarmens arterier utvikle MT ~ 25% av PD, mens cremastric arterier kan oppnå MT ~ 40% av PD. Arterier som …

Materials

			Chemical
Acetylcholine	Sigma Aldrich	A6625
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	223506
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G5767
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA)	Sigma Aldrich	E3889
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	E9884
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma Aldrich	M7506
MOPS	Sigma Aldrich	M5162
Phenylephrine	Sigma Aldrich	P6126
Potassium chloride (KCl)	Sigma Aldrich	P3911
Potassium phosphate (KH2PO4)	Sigma Aldrich	P5655
Sodium bicarbonate (NaHCO3 )	Sigma Aldrich	S6014
Sodium chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	S7653
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	S5881
Sodium nitroprusside	Sigma Aldrich	13451
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4)	Sigma Aldrich	S9638
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P8574
			Table 1.
			Physiological salt solution (1000 ml) mM KCl 4.9 0.365 g NaCl 112 6.545 g MgSO4.7H2O 1.2 0.296 g KH2PO4 1.2 0.163 g Glucose 11.5 2.072 g NaHCO3 26 2.184 g HEPES 10 2.383 g CaCl2 2 2 ml (1M stock) De-ionized water 998 ml Ca2+ free physiological salt solution (100 ml) mM KCl 4.9 0.036 g NaCl 112 0.645 g MgSO4.7H2O 1.2 0.029 g KH2PO4 1.2 0.016 g Glucose 11.5 0.207 g NaHCO3 26 0.218 g HEPES 10 0.238 g EGTA 0.39 0.015 g Sodium nitroprusside 0.1 0.0026 g De-ionized water 100 ml Dissection solution, stock (500 ml) mM NaCl 145 21.18 g KCl 4.7 0.875 g MgSO4 1.2 0.739 g MOPS 2 1.049 g EDTA 0.02 0.019 g De-ionized water 500 ml Working dissection solution (100 ml) mM Dissection solution stock 20 ml Glucose 1.2 0.091 g NaH2PO4 5 0.016 g Sodium pyruvate 2 0.022 g CaCl2 2 0.2 ml (1M stock) De-ionized water 79.8 ml
			Table 2. Composition of Experimetnal solutions
			Equipment
CCD Monochrome Camera	The imaging Source	DMK 21AU04
Single inline solution heater	Warner Instruments	64-0102
Thermistor	Warner Instruments	64-0108
Dual automatic temperature controller	Warner Instruments	TC-344B
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instruments	P-97
Fluorescence System Interface	IonOptix	model FSI-700
Forceps and scissors	World Precision Instruments
Ion Wizard-Core and Analysis	IonOptix	Ion Wizard 6.0
Laboratory tubing	Silastic	508-005
Male Sprague Dawley rat	Harlan Laboratories
Master flex console drive	Cole-parmer
Milli-Q Plus Ultrapure Water System	Millipore	ZD5211584
Ophthalmic monofilament nylon suture	Ethicon	9007G
Photometry and Dimensioning Microscope	Motic	AE31
Pressure Servo Controller with peristaltic pump and pressure transducer	Living Systems Instrumentation	PS-200
Stereomicroscope	Nikon Instruments Inc	SMZ660
Vessel Chamber	Living Systems Instrumentation	CH-1
Dissection dish	Living Systems Instrumentation	DD-90-S
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW120-6
Microforge	Stoelting	51550
			Table 3.