Bedöma Myogenic Response och vasoaktivitet I Resistance mesenteriska artärer Använda tryck Myography

Summary

Tryck myography används för att bedöma vasoaktivitet av små artärer som utvecklar ihållande sammandragning när tryck. Detta manuskript ger en detaljerad protokoll för att bedöma i isolerade segment av små mesenteriska artärer från råttor, vasoaktivitet och effekten av intraluminala trycket på vaskulära diameter.

Abstract

Små motstånd artärer tygla och vidgas respektive svar på ökad eller minskad intraluminal tryck; detta fenomen kallas myogenic svar är en viktig reglerare av lokalt blodflöde. I isobariska förhållanden små motstånd artärer utvecklar ihållande sammandragning kallas myogenic ton (MT), vilket är en viktig faktor för systemisk vaskulär resistans (SVR). Därför ex vivo trycksatta beredningar av små motstånd artärer är viktiga verktyg för att studera mikrovaskulära funktion i närheten av fysiologiska tillstånd. För att uppnå detta, är en färsk isolerad intakt segment av en liten resistans artär (diameter ~ 260 mikrometer) monteras på två små glas kanyler och trycksatt. Dessa arteriella preparat behålla de flesta in vivo egenskaper och tillståndsbedömning av kärltonus i realtid. Här ger vi ett detaljerat protokoll för att bedöma vasoaktivitet i tryck små motstånd mesenteriska artärer från råttor; dessa artärer utvecklaihållande vasokonstriktion – cirka 25% av maximal diameter – när tryck på 70 mmHg. Dessa arteriella beredningar kan användas för att studera effekten av prövnings föreningar på förhållandet mellan intraarteriell trycket och vasoaktivitet och fastställa förändringar mikrovaskulära funktion i djurmodeller av olika sjukdomar.

Introduction

Små motstånd artärer är viktiga faktorer för SVR och spelar en viktig roll i patofysiologin för många sjukdomar ^1,2. Villkor som diabetes ^3, graviditet ^4, ischemi-reperfusion ^5, övervikt och högt blodtryck ^6,7 är ofta förknippade med förändrad mikrovaskulär funktion. Kärl myography kan inte bara ge viktiga insikter i förändringar i mikrovaskulära funktion i olika sjukdomar, men också hjälpa till att identifiera terapeutiska mål och utvärdera effekten av vasoaktiva föreningar. Kärl funktion har studerats med hjälp av isolerade små artärer i isometriska eller isobariska fartygsförhållanden ^8. Detaljerad beskrivning av isometrisk myography föreskrivs någon annanstans ^9. Men det finns skillnader i uppgifter från isometrisk kontra isobariska preparat ^10-12. Eftersom tryck arteriella preparat tillåter studiet av mikrovaskulär funktion i nära fysiologiska förhållanden,erhållna resultaten kan korrelera bättre med in vivo beteende kärlbädden ^8,13.

År 1902 beskrev Bayliss första effekten av transmural tryck på vaskulära diametern ^14. Han observerade i små motstånds artärer från olika kärlbäddar av kaniner, katter och hundar som en minskning av trycket följt av vasodilatation, och en ökning av trycket följdes av vasokonstriktion. Detta fenomen är känt som myogenic svar. Bayliss och efterföljande utredare konstaterat att i isobariska förhållanden litet motstånd artärer utvecklar ihållande sammandragning kallas MT ^15,16. Kan bedömas både myogenic respons och MT med tryck myography (PM) teknik. PM används främst för att bestämma vasoaktivitet små artärer, vener och andra fartyg. Förutom att bedöma effekten av vasoaktiva föreningar på vaskulära diameter, PM – som namnet antyder – används för att bedöma intravaskulär tryckförmedlad chAnges på vaskulära diameter. Under de senaste decennierna framsteg i dataprogram som förbättrad video mikroskopi och glaspipett dragning, har gjort PM lättare att utföra. Men dissektion av livskraftiga intakta segment av små blodkärl fortfarande tråkiga och ibland utmanande. Här redogör vi ett detaljerat protokoll för att studera myogenic svar i små mesenteriala motstånd artärer isolerade från råttor.

Protocol

Exemplen som visas här är från försök som godkänts av IACUC vid Georgia Regents universitet – protokoll nr: # 2011-0408 1. Beredning av reagenser Förbered dissektion lösning lager: För 500 ml lager dissektion lösning (5x), upplösa 21,18 g NaCl, 0,875 g KCl, 0,739 g MgSO 4, 1.049 g MOPS och 0,019 g EDTA i 450 ml Milli-Q-vatten. Justera pH till 7,3 till 7,4 med användning av 1 N NaOH. Gör upp volymen till 500 ml med Milli-Q-vatten. Stamlösning kan förvaras …

Representative Results

Schematisk representation av en typisk tryck myograph ställt upp visas i Figur 1. De två ändarna av kärlet kanyleras med en glasmikropipett och fästs med suturer på båda sidor. Via rör och en öppen kranar, är en kanyl ansluten till en servostyrd tryckregulator; den andra kanylen är ansluten till en sluten avstängningskran. Kammaren är perfusion med PSS och kärl diameter förändringar observeras av ett inverterat mikroskop ansluten till en CCD-kamera. Den arter…

Discussion

Kritiska steg, felsökning och modifieringar

I en typisk isobar kärl beredning, artären under tryck vid 70 mm Hg mellan två glas kanyler perfunderade med varmt (37 ° C) PSS. Efter 30-45 minuter, artärer utveckla MT, som kännetecknas av spontan minskning i diameter som stabiliserar i 20-30 min. Motstånds artärer från olika kärlbäddar utveckla rörlig MT. Till exempel råtta motstånd mesenteriska artärer utveckla MT ~ 25% av PD, medan cremastric artärer kan uppnå MT ~ 40% av PD. Ar…

Materials

			Chemical
Acetylcholine	Sigma Aldrich	A6625
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	223506
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G5767
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA)	Sigma Aldrich	E3889
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	E9884
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma Aldrich	M7506
MOPS	Sigma Aldrich	M5162
Phenylephrine	Sigma Aldrich	P6126
Potassium chloride (KCl)	Sigma Aldrich	P3911
Potassium phosphate (KH2PO4)	Sigma Aldrich	P5655
Sodium bicarbonate (NaHCO3 )	Sigma Aldrich	S6014
Sodium chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	S7653
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	S5881
Sodium nitroprusside	Sigma Aldrich	13451
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4)	Sigma Aldrich	S9638
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P8574
			Table 1.
			Physiological salt solution (1000 ml) mM KCl 4.9 0.365 g NaCl 112 6.545 g MgSO4.7H2O 1.2 0.296 g KH2PO4 1.2 0.163 g Glucose 11.5 2.072 g NaHCO3 26 2.184 g HEPES 10 2.383 g CaCl2 2 2 ml (1M stock) De-ionized water 998 ml Ca2+ free physiological salt solution (100 ml) mM KCl 4.9 0.036 g NaCl 112 0.645 g MgSO4.7H2O 1.2 0.029 g KH2PO4 1.2 0.016 g Glucose 11.5 0.207 g NaHCO3 26 0.218 g HEPES 10 0.238 g EGTA 0.39 0.015 g Sodium nitroprusside 0.1 0.0026 g De-ionized water 100 ml Dissection solution, stock (500 ml) mM NaCl 145 21.18 g KCl 4.7 0.875 g MgSO4 1.2 0.739 g MOPS 2 1.049 g EDTA 0.02 0.019 g De-ionized water 500 ml Working dissection solution (100 ml) mM Dissection solution stock 20 ml Glucose 1.2 0.091 g NaH2PO4 5 0.016 g Sodium pyruvate 2 0.022 g CaCl2 2 0.2 ml (1M stock) De-ionized water 79.8 ml
			Table 2. Composition of Experimetnal solutions
			Equipment
CCD Monochrome Camera	The imaging Source	DMK 21AU04
Single inline solution heater	Warner Instruments	64-0102
Thermistor	Warner Instruments	64-0108
Dual automatic temperature controller	Warner Instruments	TC-344B
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instruments	P-97
Fluorescence System Interface	IonOptix	model FSI-700
Forceps and scissors	World Precision Instruments
Ion Wizard-Core and Analysis	IonOptix	Ion Wizard 6.0
Laboratory tubing	Silastic	508-005
Male Sprague Dawley rat	Harlan Laboratories
Master flex console drive	Cole-parmer
Milli-Q Plus Ultrapure Water System	Millipore	ZD5211584
Ophthalmic monofilament nylon suture	Ethicon	9007G
Photometry and Dimensioning Microscope	Motic	AE31
Pressure Servo Controller with peristaltic pump and pressure transducer	Living Systems Instrumentation	PS-200
Stereomicroscope	Nikon Instruments Inc	SMZ660
Vessel Chamber	Living Systems Instrumentation	CH-1
Dissection dish	Living Systems Instrumentation	DD-90-S
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW120-6
Microforge	Stoelting	51550
			Table 3.