Isolering af Cortical Mikroglia med bevarede immunofænotype og funktionalitet fra murine Nyfødte
Summary
En af nøglerne til en vellykket efterforskning af microglial biologi er bevarelsen af microglial immunofunction ex vivo under isolation fra CNS-væv. Isolerende microglia via roterende rystning resulterer i stærkt rene og immunofunktionel cellekulturer som vurderet af fluorescerende billeddannelse, immuncytokemi, og ELISA efter mikroglia aktivering med det proinflammatoriske stimuli (LPS) og Pam 3 CSK 4 (Pam).
Abstract
Isolering af mikroglia fra CNS væv er et kraftfuldt efterforskningsmæssige værktøj, der anvendes til at studere microglial biologi ex vivo. Den nuværende metode beskriver en procedure til isolering af mikroglia fra neonatale murine cortex ved mekanisk omrøring med en orbitalryster. Denne microglia isolation metode giver meget rene kortikale mikrogliaceller der udviser morfologiske og funktionelle egenskaber indikerer hvilende microglia i normale nonpathological forhold in vivo. Denne procedure bevarer også microglial immunofænotype og biokemisk funktionalitet som påvist ved induktion af morfologiske ændringer, nuklear translokation af p65-underenheden af NF-KB (p65) og sekretion af kendetegnende proinflammatorisk cytokin, tumornekrosefaktor-α (TNF-α ) efter lipopolysaccharid (LPS) og Pam 3 CSK 4 (Pam) udfordringer. Den foreliggende isoleringsprocedure bevarer immunofænotype både hvilende og aktiverede microglia, hvilket giver en eksperimentel metode til at undersøge mikroglia biologi i ex vivo.
Introduction
Mikrogliaceller, overvågnings makrofager i CNS parenkym omfatte omkring 12% af den samlede cellepopulation pattedyrhjernen voksen. Mikroglia er afledt fra blommesækken myeloide precursorceller og varierer i celledensitet og morfologi i forskellige cytoarchitectural regioner i den voksne CNS 1-5. I en sund voksen hjerne, microglia er små, forgrenede eller polære celler med fine, dynamiske processer. I modsætning til perifer makrofag morfologi, mikroglia demonstrere en hvilende, lavprofil fænotype hos raske hjerner, der kan fremstå som cellulær inaktivitet, men in vivo billeddiagnostiske undersøgelser viser, at microglial processer dynamisk udvide og trække for at overvåge deres mikromiljø på en måde, der minder om " prøveudtagning og landmåling "6,7.
Microglia er meget og forskelligt lydhøre over for miljø-og patofysiologiske forandringer i hjernen, skiftefra en surveillant til en effektor statslige almindeligvis betragtes som deres hvilende og aktiverede tilstande, hhv. Denne kontakt vil i aktivering kan medieres ved indgreb af membranbundne mønstergenkendelse receptorer (PRRS), såsom toll-lignende receptorer (TLRs), som svarer til patogen-associeret molekylære mønstre (PAMPs), nemlig bakterielle-og viral-afledte lipoproteiner , nukleinsyrer og kulhydrater 8-11. Udover PAMPs har PRRs også vist sig at inducere microglial aktivering mod sterile, nonpathogenic molekyler kaldet fare / skade-associeret molekylære mønstre (dæmper), som repræsenterer en perturbation i CNS homeostase, såsom cellulære skader 12-16. Når det er aktiveret, PRRs indlede en intracellulær signalering kaskade, der resulterer i ændringer i mikroglial celle morfologi og genekspression, specifikt aktiverede mikroglia tilpasse et amoeboid-lignende fænotype translokere den p65 NF-KB-underenhed (p65) til cellekernen og opregulere produIndsatsen og sekretion af proinflammatoriske cytokiner, såsom tumornekrosefaktor-α (TNF-α), interleukin-1 β (IL-1β), sammen med reaktive oxygenarter (ROS) 16-24. Selv integreret i immunresponset i CNS medfødte har disse secernerede molekyler også fundet at øge neuronal oxidativ stress, for derved at inducere og forværrer neurodegeneration i sygdomstilstande såsom Parkinsons og Alzheimers sygdom 25-29.
Dog er mekanismerne for microglial aktivering i patologiske tilstande ikke helt forstået. Derfor isolering af mikroglia er et kraftfuldt undersøgende værktøj ind i disse biologiske processer, som mange in vivo funktioner i microglial aktivering kan sammenfattet i kultur. Der findes flere metoder til isolering af mikroglia, herunder isolering via en Percoll-gradient efter enzymatisk fordøjelse af CNS-væv 30,31. Dog kan enzymatisk fordøjelse ændreden immunofænotype af cellerne ved at reducere celleoverfladeantigen ekspression 32, og resulterer i lavere celleudbytte per dyr end den heri beskrevne fremgangsmåde. Konkret rapporterer vi en gennemsnitlig microglia udbytte pr hvalp cortex på 7,5 x 10 5 celler, mens tidligere rapporteret isolation metoder fra hele CNS via en Percoll gradient udbytte 3-5 x 10 5 celler 30,33,34. Den nuværende procedure omgår brug af fordøjelsesenzymer ved at isolere microglia baseret på deres lave adhærensegenskaber og dermed bevare den microglial immunofænotype og funktionalitet.
I den foreliggende undersøgelse beskriver vi isolering af mikrogliaceller fra blandede gliaceller kulturer stammer fra neonatale heterozygote CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -) og C57BL / 6 murine cortex via mekanisk agitation på en rotationsryster, en udvidelse af tidligere publiceret metode 24,35. Vi udnytter den tidligere musestamme til nem visualisering af mikroglia somdisse mus udtrykker GFP under kontrol af den endogene CX3CR1 locus – en monocyt promotor 36-38. Denne metode frembringer meget rene microgliale kulturer med et konserveret immunofænotype ex vivo som påvist ved morfologiske ændringer, nuklear translokation af p65, og sekretion af TNF-α når udfordret med bakterielt lipopolysaccharid (LPS) eller Pam 3 CSK 4, TLR4 og TLR1 / 2 agonister hhv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nuværende procedure giver en effektiv metode til isolering af kortikale microglia fra neonatale mus. Denne fremgangsmåde har en dobbelt fordel af 1) bevarelse microglia immunofænotype og funktionalitet, som bestemt af fluorescerende billeddannelse, immuncytokemi og ELISA, og 2) at tillade mikroglia at modne i overværelse af andre gliaceller (astrocytter og oligodentrocytes) forud for isolation, hvilket kan fremme vigtige celle-celle interaktioner under glial kultur modningsperiode. Vigtigere er det, udstillet is…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIEHS R01ES014470 (KMZ).
Materials
| Glucose | Sigma | G8270 | Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 °C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM. |
| Sodium pyruvate 100 mM (100x) | Hyclone | SH30239.01 | Store at 4 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM. |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Fetal Bovine Serum (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Minimum Essential Medium Earle's (MEM) | Cellgro | 15-010-CV | Without L-glutamine. Contains Earle's salts. Used to make MCM, MGM, and DM. |
| Horse Serum | Gibco | 16050 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Cellgro | 21-021-CV | Without calcium and magnesium. Store at 4 °C. Used to make MM. |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-031 | Store at 4 °C. Used to make MM. |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | Used to stain cell nucleus. |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1. |
| Rabbit anti-NFκB (p65) | Abcam | 7970 | Used at 1/1250 dilution for ICC staining for p65. |
| Alexafluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11012 | Used at 1/1000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC. |
| 10 ml Disposable Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 50 ml Disposable Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| 15 ml Disposible Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Sterile Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1) | Roboz Surgical | RS-6010 | 1; 5 inch; used for removing head |
| Scissor: Vannas (scissor #2) |
Fine Science Tools | 15000-08 | 1; non-angled; 2.5mm cutting edge; used to open scalp |
| Scissor: Student Vannas (scissor #3) | Fine Science Tools | 91501-09 | 1; curved; used to mince brain tissue |
| Forcep: Dumont #7 (forcep #1) |
Fine Science Tools | 91197-00 | 2; used to secure nose and remove cortices |
| Forcep: Dumont #2 (forcep #2) |
Fine Science Tools | 11223-20 | 1; used to remove scalp |
| Forcep: Dumont #3 (forcep #3) |
Fine Science Tools | 11231-30 | 1; used to remove skull |
| Forcep: Dumont #5a (forcep #4) |
Fine Science Tools | 11253-21 | 1; used to remove meninges |
| Table of specific equipment | |||
| Name of Equipment | Name of Company | Catalogue Number | Comments |
| Zoom Stereo Dissection Microscope | Olympus | SZ4060 | Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet |
| Laminar-Horizontal Flow Cabinet | Nuaire | NU-201-330 | |
| Biological Safety Cabinet | Labconco | 3440001 | Class II |
| Water-Jacketed CO2 Incubator | VWR | 97025-836 | Set to 37 °C, 5% CO2 |
| Swing-out buckets | Fisher Scientific | 75006441 | To be used with Swing-out rotor |
| Swing-out Rotor | Fisher Scientific | 75006445 | Max Radius: 19.2 (cm) |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge (clinical centrifuge) |
Fisher Scientific | 75-004-377 | With swing-out rotor |
| AccuSpin Micro 17 microcentrifuge (tabletop microcentrifuge) |
Fisher Scientific | S98645 | With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524) |
References
- Ranshoff, R. M. P. V. H. Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neurosciences. 39, 151-170 (1990).
- Gomez Perdiguero, E., Schulz, C., Geissmann, F. Development and homeostasis of "resident" myeloid cells: The case of the microglia. Glia. 61, 112-120 (2013).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat. Neurosci. 16, 273-280 (2013).
- Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nature reviews. Immunology. , 11-775 (2011).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Hu, S., et al. Cytokine and free radical production by porcine microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 78, 93-96 (1996).
- Muzio, M., Polentarutti, N., Bosisio, D., Prahladan, M. K., Mantovani, A. Toll-like receptors: a growing family of immune receptors that are differentially expressed and regulated by different leukocytes. J. Leukocyte Biol. 67, 450-456 (2000).
- Lee, S. J., Lee, S. Toll-like receptors and inflammation in the CNS. Curr. Drug Targets. Inflamm. Allergy. 1, 181-191 (2002).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8, 57-69 (2007).
- Halle, A., et al. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-beta. Nat. Immunol. 9, 857-865 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Duewell, P., et al. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals. Nature. 464, 1357-1361 (2010).
- Stewart, C. R., et al. CD36 ligands promote sterile inflammation through assembly of a Toll-like receptor 4. 11, 155-161 (2010).
- Beraud, D., et al. alpha-Synuclein Alters Toll-Like Receptor Expression. Front. Neurosci. 5, 80 (2011).
- Banati, R. B., Gehrmann, J., Schubert, P., Kreutzberg, G. W. Cytotoxicity of microglia.. Glia. 7, 111-118 (1993).
- Combs, C. K., Karlo, J. C., Kao, S. C., Landreth, G. E. beta-Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNF alpha-dependent expression of induciblenitric oxide synthase and neuronal apoptosis. J. Neurosci. 21, 1179-1188 (2001).
- Kim, Y. S., Joh, T. H. Microglia, major player in the brain inflammation: their roles in the pathogenesis of Parkinson’s disease. Exp. Mol. Med. 38, 333-347 (2006).
- Colton, C., Wilcock, D. M. Assessing activation states in microglia. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 174-191 (2010).
- Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Ceramide activates microglia to enhance the production/secretion of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) without induction of deleterious factors in vitro. J. Neurochem. 80, 697-705 (2002).
- Uesugi, M., Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Nonparticipation of nuclear factor kappa B (NFkappaB) in the signaling cascade of c-JunN-terminal kinase (JNK)- and p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)-dependent tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) induction in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated microglia. Brain Res. , 1073-1074 (2006).
- Beraud, D., et al. Microglial Activation and Antioxidant Responses Induced by the Parkinson’s Disease Protein alpha-Synuclein. J. Neuroimmun. Pharmacol. 8, 94-117 (2013).
- Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson’s disease. Neurobiol. Aging. 29, 1690-1701 (2008).
- Minghetti, L., Levi, G. Microglia as effector cells in brain damage and repair: focus on prostanoids and nitric oxide. Prog. Neurobiol. 54, 99-125 (1998).
- Hirsch, E. C. Glial cells and Parkinson’s disease. J. Neurol.. 247 (2), 58-62 (2000).
- Liu, B., et al. Role of nitric oxide in inflammation-mediated neurodegeneration. Ann. NY Acad. Sci. 962, 318-331 (2002).
- Shie, F. S., Nivison, M., Hsu, P. C., Montine, T. J. Modulation of microglialinnate immunity in Alzheimer’s disease by activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Curr. Med. Chem. 16, 643-651 (2009).
- Rogers, J., Mastroeni, D., Leonard, B., Joyce, J., Grover, A. Neuroinflammation in Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease: are microglia pathogenic in either disorder. Int. Rev. Neurobiol. 82, 235-246 (2007).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murinemicroglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
- Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression. J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).
- Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J. Vis. Exp. , (2011).
- Veremeyko, T., Starossom, S. C., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. Detection of microRNAs in microglia by real-time PCR in normal CNS and during neuroinflammation. J. Vis. Exp. , (2012).
- Su, X., Federoff, H. J., Maguire-Zeiss, K. A. Mutant alpha-synuclein overexpression mediates early proinflammatory activity. Neurotox. Res. 16, 238-254 (2009).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptorCX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Imai, T., et al. Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion. Cell. 91, 521-530 (1997).
- Cardona, A. E., et al. Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor. Nat. Neurosci. 9, 917-924 (2006).
- Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57, 563-581 (1999).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus:immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
