Isolation kortikaler Mikroglia mit bewahrten Immunophänotyp und Funktionalität aus Murine Neugeborene
Summary
Ein Schlüssel zur erfolgreichen Untersuchung der Mikroglia-Biologie ist die Erhaltung der Immunfunktion Mikroglia ex vivo bei der Isolierung von ZNS-Gewebe. Trenn Mikroglia über Dreh Schütteln Ergebnisse in hochreiner und immunofunctional Zellkulturen durch Fluoreszenz-Bildgebung, Immunzytochemie, und ELISA folgenden Mikroglia-Aktivierung mit der proinflammatorische Stimuli Lipopolysaccharide (LPS) und Pam 3 4 CSK (Pam) bewertet.
Abstract
Die Isolierung der Mikroglia von ZNS-Gewebe ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um investigative Mikroglia Biologie studieren ex vivo. Das vorliegende Verfahren Details ein Verfahren zur Isolierung von murinen Mikroglia von neonatalen Kortex durch mechanische Bewegung mit einem Rotationsschüttler. Diese Methode liefert Mikroglia Isolierung hochreiner kortikalen Mikrogliazellen, die morphologischen und funktionellen Eigenschaften in normalen, nicht pathologischen Bedingungen in vivo bezeichnend für Ruhe Mikroglia aufweisen. Dieses Verfahren bewahrt auch die Mikro Immunphänotyps und biochemischen Funktionen, wie durch die Induktion der morphologischen Veränderungen, die nukleäre Translokation der p65-Untereinheit von NF-kB (p65), und Sekretion des proinflammatorischen Zytokins Markenzeichen, Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α nachgewiesen ), auf Lipopolysaccharide (LPS) und Pam 3 4 CSK (Pam) Herausforderungen. Daher erhält das vorliegende Verfahren die Isolierung Immunophänotyp sowohl Ruhe und aktivierenviert Mikroglia und bietet eine experimentelle Methode zur Untersuchung der Biologie in Mikroglia ex vivo-Bedingungen.
Introduction
Mikrogliazellen, die Überwachungs Makrophagen des ZNS Parenchym, umfassen etwa 12% der Gesamtzellpopulation des erwachsenen Gehirns von Säugetieren. Mikrogliazellen sind aus Dottersack myeloischen Vorläuferzellen abgeleitet und variieren in der Zelldichte und Morphologie in verschiedenen cytoarchitectural Regionen innerhalb der adulten ZNS 05.01. In einem gesunden erwachsenen Gehirn sind Mikroglia kleinen, verzweigten oder polaren Zellen mit feinen, dynamischen Prozessen. Im Gegensatz zu peripheren Makrophagen Morphologie, Mikrogliazellen zeigen eine Ruhe, Low-Profile-Phänotyp in gesunden Gehirnen, die als zelluläre Inaktivität erscheinen können, aber in-vivo-Imaging-Studien zeigen, dass die Mikroglia-Prozesse dynamisch aus-und einfahren, um ihre Mikroumgebung überwachen in einer Art und Weise erinnert an " Probenahme-und Vermessungs "6,7.
Mikroglia sind stark unterschiedlich und als Reaktion auf Umwelt und pathophysiologischen Veränderungen im Gehirn, Schaltvon einem Wacher zu einer Effektor-Zustand häufig als ihre Ruhe angesehen und aktivierten Zustände auf. Dieser Schalter kann bei der Aktivierung durch den Eingriff der membrangebundenen Mustererkennungsrezeptoren (PRRS), wie etwa Toll-like Rezeptoren (TLR), die pathogen-associated molecular Muster reagieren (PAMPS), nämlich Bakterien-und Virus-abgeleitete Lipoproteine vermittelt , Nukleinsäuren, Kohlenhydrate und 8-11. Zusätzlich zu PAMPs haben KFVs auch gezeigt, dass Mikroglia-Aktivierung gegen steriles, nicht-pathogenen Molekülen Gefahr / Beschädigung assoziierte molekulare Muster (gedämpft) bekannt, die eine Störung der Homöostase im ZNS darstellen, wie beispielsweise Zellschäden induzieren 12-16. Einmal aktiviert, PRRs initiieren eine intrazelluläre Signalkaskade, die zu Veränderungen in Mikroglia-Zellmorphologie und Genexpression führt, insbesondere aktivierte Mikroglia eine Anpassung amoeboid-ähnlichen Phänotyp, die p65 transloziert NF-kB-Untereinheit (p65) in den Zellkern und regulieren die production und Sekretion von proinflammatorischen Cytokinen, wie Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α), Interleukin-1 β (IL-1β), zusammen mit reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), 16-24. Obwohl integral an der angeborenen Immunantwort des ZNS haben diese Moleküle sezerniert wurde auch gefunden, neuronale oxidativen Stress zu erhöhen, wodurch induzieren und verschlimmern Neurodegeneration bei Krankheitszuständen, wie Parkinson-und Alzheimer-Krankheit 25-29.
Jedoch sind die Mechanismen der Mikroglia-Aktivierung in pathologischen Zuständen nicht vollständig verstanden. Daher Isolierung der Mikroglia ist ein leistungsfähiges Werkzeug in Untersuchungs dieser biologischen Prozesse, wie viele in-vivo-Funktionen von Mikroglia-Aktivierung in Kultur rekapituliert werden. Es sind mehrere Verfahren zur Isolierung von Mikroglia, einschließlich Isolierung über einen Percoll-Gradienten folgende enzymatische Verdauung von ZNS-Gewebe 30,31 erhältlich. Allerdings enzymatische Verdauung verändern könnender Immunphänotyp der Zellen, indem Zelloberflächenantigen-Expression 32 und führt zu einer geringeren Zellausbeute pro Tier als dem hier beschriebenen Verfahren. Insbesondere weisen wir einen durchschnittlichen Ertrag pro Welpe Mikroglia Kortex von 7,5 x 10 5 Zellen, während zuvor berichtet Isolierungsverfahren aus ganzen ZNS über einen Percoll-Gradienten Ausbeute 5.3 x 10 5 Zellen 30,33,34. Das vorliegende Verfahren umgeht die Verwendung von Verdauungsenzymen durch Isolierung Mikroglia auf der Grundlage ihrer niedrigen Hafteigenschaften, wodurch die Mikro Immunophänotyp und Funktionalität erhalten bleibt.
In der vorliegenden Studie beschreiben wir die Isolierung von Mikroglia-Zellen aus gemischten Glia-Kulturen aus Neugeborenen-heterozygoten CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -) abgeleitet und C57BL / 6 Mäuse Kortex über mechanische Bewegung auf einem Rotationsschüttler, eine Erweiterung der zuvor publizierten Methode 24,35. Wir nutzen die ehemaligen Mausstamm für die einfache Visualisierung von Mikrogliazellen, alsDiese Mäuse exprimieren GFP unter der Kontrolle des endogenen Locus CX3CR1 – ein Monozyten-spezifische Promotor 36-38. Dieses Verfahren erzeugt sehr reine Mikrokulturen mit dem erhaltenen Immunphänotyps ex vivo, wie durch morphologische Veränderungen, die nukleäre Translokation von p65 und Sekretion von TNF-α nachgewiesen, wenn mit bakteriellem Lipopolysaccharid (LPS) oder Pam 3 CSK 4 gefordert, TLR4 und TLR1 / 2-Agonisten sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das vorliegende Verfahren bietet eine effektive Methode zur Isolierung der kortikalen Mikrogliazellen von neugeborenen Mäusen. Dieses Verfahren hat einen zweifachen Vorteil 1) Erhaltung Mikroglia Immunphänotyps und Funktionalität, wie durch Fluoreszenz-Bildgebung, Immunzytochemie und ELISA bestimmt, und 2) ermöglicht Mikroglia in der Gegenwart von anderen Gliazellen (Astrozyten und oligodentrocytes) vor dem reifen Isolation, die während der Gliazellen Kultur Reifezeit wichtige Zell-Zell-Interaktionen ermöglichen k…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von NIEHS R01ES014470 (KMZ) unterstützt.
Materials
| Glucose | Sigma | G8270 | Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 °C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM. |
| Sodium pyruvate 100 mM (100x) | Hyclone | SH30239.01 | Store at 4 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM. |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Fetal Bovine Serum (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Minimum Essential Medium Earle's (MEM) | Cellgro | 15-010-CV | Without L-glutamine. Contains Earle's salts. Used to make MCM, MGM, and DM. |
| Horse Serum | Gibco | 16050 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Cellgro | 21-021-CV | Without calcium and magnesium. Store at 4 °C. Used to make MM. |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-031 | Store at 4 °C. Used to make MM. |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | Used to stain cell nucleus. |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1. |
| Rabbit anti-NFκB (p65) | Abcam | 7970 | Used at 1/1250 dilution for ICC staining for p65. |
| Alexafluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11012 | Used at 1/1000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC. |
| 10 ml Disposable Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 50 ml Disposable Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| 15 ml Disposible Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Sterile Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1) | Roboz Surgical | RS-6010 | 1; 5 inch; used for removing head |
| Scissor: Vannas (scissor #2) |
Fine Science Tools | 15000-08 | 1; non-angled; 2.5mm cutting edge; used to open scalp |
| Scissor: Student Vannas (scissor #3) | Fine Science Tools | 91501-09 | 1; curved; used to mince brain tissue |
| Forcep: Dumont #7 (forcep #1) |
Fine Science Tools | 91197-00 | 2; used to secure nose and remove cortices |
| Forcep: Dumont #2 (forcep #2) |
Fine Science Tools | 11223-20 | 1; used to remove scalp |
| Forcep: Dumont #3 (forcep #3) |
Fine Science Tools | 11231-30 | 1; used to remove skull |
| Forcep: Dumont #5a (forcep #4) |
Fine Science Tools | 11253-21 | 1; used to remove meninges |
| Table of specific equipment | |||
| Name of Equipment | Name of Company | Catalogue Number | Comments |
| Zoom Stereo Dissection Microscope | Olympus | SZ4060 | Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet |
| Laminar-Horizontal Flow Cabinet | Nuaire | NU-201-330 | |
| Biological Safety Cabinet | Labconco | 3440001 | Class II |
| Water-Jacketed CO2 Incubator | VWR | 97025-836 | Set to 37 °C, 5% CO2 |
| Swing-out buckets | Fisher Scientific | 75006441 | To be used with Swing-out rotor |
| Swing-out Rotor | Fisher Scientific | 75006445 | Max Radius: 19.2 (cm) |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge (clinical centrifuge) |
Fisher Scientific | 75-004-377 | With swing-out rotor |
| AccuSpin Micro 17 microcentrifuge (tabletop microcentrifuge) |
Fisher Scientific | S98645 | With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524) |
References
- Ranshoff, R. M. P. V. H. Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neurosciences. 39, 151-170 (1990).
- Gomez Perdiguero, E., Schulz, C., Geissmann, F. Development and homeostasis of "resident" myeloid cells: The case of the microglia. Glia. 61, 112-120 (2013).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat. Neurosci. 16, 273-280 (2013).
- Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nature reviews. Immunology. , 11-775 (2011).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Hu, S., et al. Cytokine and free radical production by porcine microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 78, 93-96 (1996).
- Muzio, M., Polentarutti, N., Bosisio, D., Prahladan, M. K., Mantovani, A. Toll-like receptors: a growing family of immune receptors that are differentially expressed and regulated by different leukocytes. J. Leukocyte Biol. 67, 450-456 (2000).
- Lee, S. J., Lee, S. Toll-like receptors and inflammation in the CNS. Curr. Drug Targets. Inflamm. Allergy. 1, 181-191 (2002).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8, 57-69 (2007).
- Halle, A., et al. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-beta. Nat. Immunol. 9, 857-865 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Duewell, P., et al. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals. Nature. 464, 1357-1361 (2010).
- Stewart, C. R., et al. CD36 ligands promote sterile inflammation through assembly of a Toll-like receptor 4. 11, 155-161 (2010).
- Beraud, D., et al. alpha-Synuclein Alters Toll-Like Receptor Expression. Front. Neurosci. 5, 80 (2011).
- Banati, R. B., Gehrmann, J., Schubert, P., Kreutzberg, G. W. Cytotoxicity of microglia.. Glia. 7, 111-118 (1993).
- Combs, C. K., Karlo, J. C., Kao, S. C., Landreth, G. E. beta-Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNF alpha-dependent expression of induciblenitric oxide synthase and neuronal apoptosis. J. Neurosci. 21, 1179-1188 (2001).
- Kim, Y. S., Joh, T. H. Microglia, major player in the brain inflammation: their roles in the pathogenesis of Parkinson’s disease. Exp. Mol. Med. 38, 333-347 (2006).
- Colton, C., Wilcock, D. M. Assessing activation states in microglia. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 174-191 (2010).
- Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Ceramide activates microglia to enhance the production/secretion of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) without induction of deleterious factors in vitro. J. Neurochem. 80, 697-705 (2002).
- Uesugi, M., Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Nonparticipation of nuclear factor kappa B (NFkappaB) in the signaling cascade of c-JunN-terminal kinase (JNK)- and p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)-dependent tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) induction in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated microglia. Brain Res. , 1073-1074 (2006).
- Beraud, D., et al. Microglial Activation and Antioxidant Responses Induced by the Parkinson’s Disease Protein alpha-Synuclein. J. Neuroimmun. Pharmacol. 8, 94-117 (2013).
- Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson’s disease. Neurobiol. Aging. 29, 1690-1701 (2008).
- Minghetti, L., Levi, G. Microglia as effector cells in brain damage and repair: focus on prostanoids and nitric oxide. Prog. Neurobiol. 54, 99-125 (1998).
- Hirsch, E. C. Glial cells and Parkinson’s disease. J. Neurol.. 247 (2), 58-62 (2000).
- Liu, B., et al. Role of nitric oxide in inflammation-mediated neurodegeneration. Ann. NY Acad. Sci. 962, 318-331 (2002).
- Shie, F. S., Nivison, M., Hsu, P. C., Montine, T. J. Modulation of microglialinnate immunity in Alzheimer’s disease by activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Curr. Med. Chem. 16, 643-651 (2009).
- Rogers, J., Mastroeni, D., Leonard, B., Joyce, J., Grover, A. Neuroinflammation in Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease: are microglia pathogenic in either disorder. Int. Rev. Neurobiol. 82, 235-246 (2007).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murinemicroglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
- Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression. J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).
- Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J. Vis. Exp. , (2011).
- Veremeyko, T., Starossom, S. C., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. Detection of microRNAs in microglia by real-time PCR in normal CNS and during neuroinflammation. J. Vis. Exp. , (2012).
- Su, X., Federoff, H. J., Maguire-Zeiss, K. A. Mutant alpha-synuclein overexpression mediates early proinflammatory activity. Neurotox. Res. 16, 238-254 (2009).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptorCX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Imai, T., et al. Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion. Cell. 91, 521-530 (1997).
- Cardona, A. E., et al. Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor. Nat. Neurosci. 9, 917-924 (2006).
- Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57, 563-581 (1999).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus:immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
