Murine नवजात शिशुओं से संरक्षित Immunophenotype और कार्यक्षमता के साथ Cortical Microglia का अलगाव
Summary
Microglial जीव विज्ञान की सफल जांच करने के लिए एक प्रमुख सीएनएस ऊतक से अलगाव के दौरान पूर्व vivo microglial immunofunction का संरक्षण है. फ्लोरोसेंट इमेजिंग, immunocytochemistry, और proinflammatory उत्तेजनाओं (LPS) lipopolysaccharide और पाम 3 CSK 4 (पाम) के साथ एलिसा निम्नलिखित microglia सक्रियण द्वारा मूल्यांकन के रूप में अत्यधिक शुद्ध और immunofunctional सेल संस्कृतियों में रोटरी मिलाते हुए परिणामों के माध्यम से microglia अलग.
Abstract
सीएनएस ऊतक से microglia के अलगाव पूर्व vivo microglial जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल एक शक्तिशाली खोजी उपकरण है. वर्तमान विधि एक रोटरी प्रकार के बरतन के साथ यांत्रिक आंदोलन से नवजात murine cortices से microglia के अलगाव के लिए एक प्रक्रिया का विवरण. इस microglia अलगाव विधि पैदावार vivo में सामान्य, nonpathological स्थितियों में मौन microglia का संकेत रूपात्मक और कार्यात्मक लक्षण दिखा रहे हैं कि अत्यधिक शुद्ध cortical microglia. Morphological परिवर्तन, NF-κB (p65) की p65 सबयूनिट के परमाणु स्थानान्तरण, और बानगी proinflammatory साइटोकाइन का स्राव, ट्यूमर परिगलन कारक α (TNF-α के शामिल होने के द्वारा प्रदर्शन के रूप में इस प्रक्रिया का भी microglial immunophenotype और जैव रासायनिक कार्यक्षमता को बरकरार रखता है ), (LPS) lipopolysaccharide और पाम 3 CSK 4 (पाम) चुनौतियों पर. इसलिए, वर्तमान अलगाव प्रक्रिया मौन और acti दोनों की immunophenotype को बरकरार रखता हैपूर्व vivo परिस्थितियों में microglia जीव विज्ञान की जांच का एक प्रयोगात्मक विधि उपलब्ध कराने बढ़ा microglia,.
Introduction
Microglial कोशिकाओं, सीएनएस पैरेन्काइमा की निगरानी मैक्रोफेज, वयस्क स्तनधारी मस्तिष्क की कुल सेल की आबादी का लगभग 12% शामिल. Microglia जर्दी थैली माइलॉयड अग्रदूत साबित कोशिकाओं से व्युत्पन्न और वयस्क सीएनएस 1-5 भीतर विभिन्न कोशिकाओं की व्यवस्था से संबंधित क्षेत्रों में सेल घनत्व और आकारिकी में भिन्नता है. एक स्वस्थ वयस्क दिमाग में, microglia ठीक, गतिशील प्रक्रियाओं के साथ, छोटे डालियां फैला हुआ या ध्रुवीय कोशिकाओं रहे हैं. हालांकि, vivo इमेजिंग अध्ययन microglial प्रक्रियाओं को गतिशील "की याद ताजा तरीके से विस्तार करने और उनके microenvironment नजर रखने के लिए वापस लेना है कि प्रदर्शन, परिधीय बृहतभक्षककोशिका आकारिकी के विपरीत, microglia सेलुलर निष्क्रियता के रूप में प्रकट हो सकता है कि स्वस्थ दिमाग में एक मौन, कम प्रोफ़ाइल फेनोटाइप का प्रदर्शन नमूना और "6,7 सर्वेक्षण.
Microglia स्विचन, अत्यधिक और विभिन्न मस्तिष्क में पर्यावरण और pathophysiological परिवर्तन के लिए उत्तरदायी हैंक्रमश: एक प्रेरक राज्य सामान्यतः उनके आराम के रूप में माना गया है और सक्रिय राज्यों को surveillant से. सक्रियण में यह स्विच ऐसी रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न का जवाब जो टोल की तरह रिसेप्टर्स (TLRs), (PAMPs), अर्थात् बैक्टीरियल और वायरल व्युत्पन्न लिपो प्रोटीन के रूप में झिल्ली ही सीमित पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (PRRs), की सगाई द्वारा मध्यस्थता जा सकता है , न्यूक्लिक एसिड, और कार्बोहाइड्रेट 8-11. PAMPs के अलावा, PRRs भी ऐसे सेलुलर क्षति 12-16 के रूप में सीएनएस homeostasis में एक गड़बड़ी का प्रतिनिधित्व करते हैं जो खतरे / क्षति जुड़े आणविक पैटर्न (damps) के रूप में जाना जाता है बाँझ, nonpathogenic अणु, के खिलाफ microglial सक्रियण प्रेरित दिखाया गया है. एक बार जब लगे, PRRs microglial सेल आकारिकी और जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन में यह परिणाम है कि झरना संकेत एक intracellular आरंभ, विशेष रूप से, सक्रिय microglia, एक अमीबाभ तरह फेनोटाइप अनुकूलन सेल नाभिक को p65 NF-κB सबयूनिट (p65) सरकाना, और upregulate उत्पादों होगाction और ऐसे प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) 16-24 के साथ ट्यूमर परिगलन कारक α (TNF-α), इंटरल्यूकिन 1 β (आईएल 1β), के रूप में proinflammatory साइटोकिन्स, का स्राव. सीएनएस की सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में अभिन्न हालांकि, इन स्रावित अणु भी जिससे पार्किंसंस और अल्जाइमर रोग 25-29 के रूप में रोगग्रस्त राज्यों में neurodegeneration उत्प्रेरण और exacerbating, neuronal oxidative तनाव बढ़ाने के लिए पाया गया है.
हालांकि, रोग राज्यों में microglial सक्रियण के तंत्र को पूरी तरह से समझ नहीं रहे हैं. Microglial सक्रियण के विवो सुविधाओं में कई संस्कृति में recapitulated किया जा सकता है के रूप में इसलिए, microglia के अलगाव, इन जैविक प्रक्रियाओं में एक शक्तिशाली खोजी उपकरण है. कई तरीकों सीएनएस ऊतक 30,31 के enzymatic पाचन के बाद एक Percoll ढाल के माध्यम से अलगाव सहित microglia, अलग करने के लिए उपलब्ध हैं. हालांकि, enzymatic पाचन बदल सकते हैंप्रतिजन अभिव्यक्ति 32 सेल सतह को कम करने, और इस के साथ साथ वर्णित विधि की तुलना में पशु प्रति कम सेल उपज में परिणाम द्वारा कोशिकाओं की immunophenotype. पहले एक Percoll ढाल उपज 3-5 x 10 5 कोशिकाओं 30,33,34 के माध्यम से पूरे सीएनएस से अलगाव तरीकों की सूचना दी है, जबकि विशेष रूप से, हम, 7.5 x 10 5 कोशिकाओं का पिल्ला प्रांतस्था औसतन microglia उपज की रिपोर्ट. वर्तमान प्रक्रिया जिससे microglial immunophenotype और कार्यक्षमता के संरक्षण, उनके कम पालन गुणों के आधार पर microglia अलग से पाचन एंजाइमों के उपयोग में गतिरोध उत्पन्न.
एक रोटरी प्रकार के बरतन, पहले से ही विस्तार पर यांत्रिक आंदोलन के माध्यम से, और C57BL 6 / murine cortices – अध्ययन में मौजूद है, हम नवजात विषमयुग्मजी CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + /) से व्युत्पन्न मिश्रित glial संस्कृतियों से microglial कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन प्रकाशित विधि 24,35. हम microglia की आसान दृश्य के लिए पूर्व माउस तनाव का उपयोग, के रूप मेंएक monocyte विशिष्ट प्रमोटर 36-38 – इन चूहों अंतर्जात Cx3Cr1 लोकस के नियंत्रण के तहत व्यक्त GFP. यह विधि एक संरक्षित immunophenotype पूर्व vivo जीवाणु (LPS) lipopolysaccharide या पाम 3 CSK 4 के साथ चुनौती दी जब morphological परिवर्तन, p65 के परमाणु स्थानान्तरण, और TNF-α के स्राव द्वारा प्रदर्शन के रूप में, TLR4 और TLR1 / 2 agonists के साथ अत्यधिक शुद्ध microglial संस्कृतियों का उत्पादन , क्रमशः.
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान प्रक्रिया नवजात चूहों से cortical microglia के अलगाव के लिए एक प्रभावी तरीका प्रदान करता है. यह प्रक्रिया फ्लोरोसेंट इमेजिंग, immunocytochemistry, और एलिसा द्वारा निर्धारित रूप में, 1) के संरक्षण microglia immunophenotype और कार्यक्ष?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम NIEHS R01ES014470 (KMZ) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Glucose | Sigma | G8270 | Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 °C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM. |
| Sodium pyruvate 100 mM (100x) | Hyclone | SH30239.01 | Store at 4 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM. |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Fetal Bovine Serum (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Minimum Essential Medium Earle's (MEM) | Cellgro | 15-010-CV | Without L-glutamine. Contains Earle's salts. Used to make MCM, MGM, and DM. |
| Horse Serum | Gibco | 16050 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Cellgro | 21-021-CV | Without calcium and magnesium. Store at 4 °C. Used to make MM. |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-031 | Store at 4 °C. Used to make MM. |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | Used to stain cell nucleus. |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1. |
| Rabbit anti-NFκB (p65) | Abcam | 7970 | Used at 1/1250 dilution for ICC staining for p65. |
| Alexafluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11012 | Used at 1/1000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC. |
| 10 ml Disposable Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 50 ml Disposable Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| 15 ml Disposible Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Sterile Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1) | Roboz Surgical | RS-6010 | 1; 5 inch; used for removing head |
| Scissor: Vannas (scissor #2) |
Fine Science Tools | 15000-08 | 1; non-angled; 2.5mm cutting edge; used to open scalp |
| Scissor: Student Vannas (scissor #3) | Fine Science Tools | 91501-09 | 1; curved; used to mince brain tissue |
| Forcep: Dumont #7 (forcep #1) |
Fine Science Tools | 91197-00 | 2; used to secure nose and remove cortices |
| Forcep: Dumont #2 (forcep #2) |
Fine Science Tools | 11223-20 | 1; used to remove scalp |
| Forcep: Dumont #3 (forcep #3) |
Fine Science Tools | 11231-30 | 1; used to remove skull |
| Forcep: Dumont #5a (forcep #4) |
Fine Science Tools | 11253-21 | 1; used to remove meninges |
| Table of specific equipment | |||
| Name of Equipment | Name of Company | Catalogue Number | Comments |
| Zoom Stereo Dissection Microscope | Olympus | SZ4060 | Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet |
| Laminar-Horizontal Flow Cabinet | Nuaire | NU-201-330 | |
| Biological Safety Cabinet | Labconco | 3440001 | Class II |
| Water-Jacketed CO2 Incubator | VWR | 97025-836 | Set to 37 °C, 5% CO2 |
| Swing-out buckets | Fisher Scientific | 75006441 | To be used with Swing-out rotor |
| Swing-out Rotor | Fisher Scientific | 75006445 | Max Radius: 19.2 (cm) |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge (clinical centrifuge) |
Fisher Scientific | 75-004-377 | With swing-out rotor |
| AccuSpin Micro 17 microcentrifuge (tabletop microcentrifuge) |
Fisher Scientific | S98645 | With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524) |
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