Isolamento della corticale Microglia con Immunofenotipo conservato e funzionalità dal murini neonati
Summary
Una chiave per il successo indagini di biologia microglia è la conservazione dei immunofunction microglia ex vivo durante l'isolamento dal tessuto del sistema nervoso centrale. Isolare microglia via rotanti risultati si stringono in colture cellulari altamente puri e immunofunctional come valutato da immagini fluorescenti, immunocitochimica, ed ELISA dopo l'attivazione della microglia con il lipopolisaccaride stimoli pro-infiammatori (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).
Abstract
Isolamento di microglia dal tessuto del sistema nervoso centrale è un potente strumento di indagine utilizzato per studiare biologia microglia ex vivo. Il presente metodo dettaglia un procedimento per l'isolamento di microglia da cortecce neonatali murini mediante agitazione meccanica con un agitatore rotante. Questo isolamento microglia metodo rendimenti microglia corticali purissime che presentano caratteristiche morfologiche e funzionali indicative di microglia quiescenti in condizioni non patologiche normali in vivo. Questa procedura preserva anche la immunofenotipo microglia e funzionalità biochimica come dimostra l'induzione di modificazioni morfologiche, traslocazione nucleare della subunità p65 di NF-kB (p65), e la secrezione della citochina proinfiammatoria segno distintivo, fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α ), su lipopolisaccaride (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam) sfide. Pertanto, l'attuale procedura di isolamento conserva l'immunofenotipo sia quiescente e attivamicroglia vato, fornendo un metodo sperimentale di investigare microglia biologia ex vivo condizioni.
Introduction
Cellule microgliali, i macrofagi sorveglianza del parenchima SNC, comprendono circa il 12% della popolazione totale di cellule del cervello dei mammiferi adulti. Microglia sono derivati dal sacco vitellino mieloidi precursori delle cellule e variano in densità cellulare e morfologia in diverse regioni cytoarchitectural all'interno del SNC adulto 1-5. In un cervello adulto sano, microglia sono piccoli, ramificati o polari cellule con raffinati processi dinamici. In contrasto con macrofagi morfologia periferico, microglia dimostrano una quiescente, basso profilo fenotipo in cervelli sani che possono apparire come l'inattività cellulare, tuttavia, vivo studi di imaging de dimostrano che i processi microgliali si estendono in modo dinamico e ritraggono per monitorare il loro microambiente in un modo che ricorda " campionamento e rilevamento "6,7.
Microglia sono altamente e differenzialmente sensibili alle alterazioni ambientali e patofisiologici nel cervello, commutazioneda una surveillant a un effettrici stati, rispettivamente statali comunemente considerato come il loro riposo e attivato. Questo interruttore di attivazione può essere mediata da un blocco del recettori di membrana pattern recognition (PRR), come i recettori toll-like (TLR), che rispondono a modelli molecolari associati ai patogeni (PAMP), lipoproteine vale a dire-batteriche e virali derivati , acidi nucleici, carboidrati e 8-11. Oltre a PAMPs, PRRs hanno dimostrato di indurre l'attivazione della microglia contro sterili, molecole patogene conosciute come modelli molecolari pericolo / danno associato (smorza), che rappresentano una perturbazione nel sistema nervoso centrale dell'omeostasi, come danno cellulare 12-16. Una volta inserita, PRRs avviare una cascata di segnalazione intracellulare che si traduce in cambiamenti nella morfologia cellulare e l'espressione genica microglia, in particolare, microglia attivata adattare un fenotipo ameboide-like, traslocare la p65 NF-kB subunità (p65) al nucleo della cellula, e il potenziamento della produttoriction e la secrezione di citochine proinfiammatorie, come fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α), interleuchina-1 β (IL-1β), insieme con le specie reattive dell'ossigeno (ROS) 16-24. Sebbene integrale nella risposta immunitaria innata del sistema nervoso centrale, queste molecole secrete sono stati trovati anche ad aumentare lo stress ossidativo neuronale, inducendo in tal modo aggravando e neurodegenerazione in stati malati come il Parkinson e il morbo di Alzheimer 25-29.
Tuttavia, i meccanismi di attivazione della microglia in stati patologici non sono del tutto chiare. Pertanto, l'isolamento di microglia è un potente strumento di indagine in tali processi biologici, come molti nelle caratteristiche vivo di attivazione della microglia può essere ricapitolato in cultura. Sono disponibili diversi metodi per isolare microglia, compreso l'isolamento con gradiente Percoll seguente digestione enzimatica del tessuto CNS 30,31. Tuttavia, la digestione enzimatica può alterarel'immunofenotipo delle cellule riducendo superficie cellulare espressione dell'antigene 32, e si traduce in quantità di cellule per animale inferiore rispetto al metodo qui descritto. In particolare, si segnala un rendimento medio microglia per pup corteccia di 7,5 x 10 5 cellule, mentre precedentemente riportato metodi di isolamento da tutto CNS con gradiente resa Percoll 3-5 x 10 5 cellule 30,33,34. Il presente procedimento elude l'uso di enzimi digestivi isolando microglia in base alle loro proprietà a bassa aderenza, preservando così l'immunofenotipo microglia e funzionalità.
Nel presente studio, si descrive l'isolamento di cellule microgliali da colture gliali miste derivate da neonati eterozigoti CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -), e C57BL / 6 cortecce murini tramite agitazione meccanica su un agitatore rotante, una proroga di precedenza metodo pubblicato 24,35. Utilizziamo il primo ceppo di topi per una facile visualizzazione di microglia, comequesti topi esprimono GFP sotto il controllo del locus endogeno CX3CR1 – un promotore specifico monociti 36-38. Questo metodo produce colture microgliali altamente puri con una preservata immunofenotipo ex vivo, come dimostrato dai cambiamenti morfologici, traslocazione nucleare di p65, e la secrezione di TNF-α quando provocati con lipopolisaccaride batterico (LPS) o Pam 3 CSK 4, TLR4 e TLR1 / 2 agonisti rispettivamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il presente procedimento offre un metodo efficace per l'isolamento di microglia corticali di topi neonati. Questa procedura ha un duplice vantaggio di 1) conservare immunofenotipo microglia e funzionalità, come determinato mediante imaging fluorescente, immunocitochimica e ELISA, e, 2) permettendo microglia di maturare in presenza di altre cellule gliali (astrociti e oligodentrocytes) prima isolamento, che può facilitare importanti interazioni cellula-cellula durante il periodo di coltura maturazione gliale. È im…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal NIEHS R01ES014470 (KMZ).
Materials
| Glucose | Sigma | G8270 | Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 °C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM. |
| Sodium pyruvate 100 mM (100x) | Hyclone | SH30239.01 | Store at 4 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM. |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Fetal Bovine Serum (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Minimum Essential Medium Earle's (MEM) | Cellgro | 15-010-CV | Without L-glutamine. Contains Earle's salts. Used to make MCM, MGM, and DM. |
| Horse Serum | Gibco | 16050 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Cellgro | 21-021-CV | Without calcium and magnesium. Store at 4 °C. Used to make MM. |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-031 | Store at 4 °C. Used to make MM. |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | Used to stain cell nucleus. |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1. |
| Rabbit anti-NFκB (p65) | Abcam | 7970 | Used at 1/1250 dilution for ICC staining for p65. |
| Alexafluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11012 | Used at 1/1000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC. |
| 10 ml Disposable Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 50 ml Disposable Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| 15 ml Disposible Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Sterile Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1) | Roboz Surgical | RS-6010 | 1; 5 inch; used for removing head |
| Scissor: Vannas (scissor #2) |
Fine Science Tools | 15000-08 | 1; non-angled; 2.5mm cutting edge; used to open scalp |
| Scissor: Student Vannas (scissor #3) | Fine Science Tools | 91501-09 | 1; curved; used to mince brain tissue |
| Forcep: Dumont #7 (forcep #1) |
Fine Science Tools | 91197-00 | 2; used to secure nose and remove cortices |
| Forcep: Dumont #2 (forcep #2) |
Fine Science Tools | 11223-20 | 1; used to remove scalp |
| Forcep: Dumont #3 (forcep #3) |
Fine Science Tools | 11231-30 | 1; used to remove skull |
| Forcep: Dumont #5a (forcep #4) |
Fine Science Tools | 11253-21 | 1; used to remove meninges |
| Table of specific equipment | |||
| Name of Equipment | Name of Company | Catalogue Number | Comments |
| Zoom Stereo Dissection Microscope | Olympus | SZ4060 | Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet |
| Laminar-Horizontal Flow Cabinet | Nuaire | NU-201-330 | |
| Biological Safety Cabinet | Labconco | 3440001 | Class II |
| Water-Jacketed CO2 Incubator | VWR | 97025-836 | Set to 37 °C, 5% CO2 |
| Swing-out buckets | Fisher Scientific | 75006441 | To be used with Swing-out rotor |
| Swing-out Rotor | Fisher Scientific | 75006445 | Max Radius: 19.2 (cm) |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge (clinical centrifuge) |
Fisher Scientific | 75-004-377 | With swing-out rotor |
| AccuSpin Micro 17 microcentrifuge (tabletop microcentrifuge) |
Fisher Scientific | S98645 | With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524) |
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