쥐과 신생아에서 보존 면역 표현형과 기능으로 두피 소교 세포의 분리
Summary
미세 아교 세포 생물학의 성공적인 조사에 하나의 키는 CNS의 조직으로부터 분리하는 동안 생체 미세 아교 immunofunction의 보존이다. 형광 이미징, 면역 세포 화학, 및 염증성 자극 지질 다당류 (LPS)와 팸 3 CSK 4 (팸)와 ELISA 다음 미세 아교 세포의 활성에 의해 평가 매우 순수하고 immunofunctional 세포 배양에 회전 흔들림 결과를 통해 미세 아교 세포를 분리.
Abstract
CNS 조직에서 미세 아교 세포의 분리 생체 미세 아교 세포 생물학을 연구하는 데 사용하는 강력한 조사 도구입니다. 본 발명의 방법은 회전 쉐이커 기계 교반에 의한 신생아 쥐의 피질에서 미세 아교 세포의 분리를위한 절차를 자세히 설명합니다. 이 미세 아교 세포의 분리 방법 수율 생체 내에서 정상 nonpathological 조건에서 대기 미세 아교 세포 나타내는 형태 학적 및 기능적 특성을 나타내는 순도가 매우 높은 대뇌 피질의 미세 아교 세포. 형태 학적 변화, NF-κB (P65)의 P65 서브 유닛의 핵 전좌하고 각인 전 염증성 사이토 카인의 분비, 종양 괴사 인자-α (TNF-α의 유도에 의해 설명 된대로이 절차는 또한 미세 아교 세포 면역 표현형, 생화학 적 기능을 유지 ), 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)와 팸 3 CSK 4 (팸) 문제시. 따라서, 본 분리 절차는 대기와 함께하는 양의 면역 표현형을 유지생체 조건에서 미세 아교 세포 생물학을 연구의 실험 방법을 제공 vated의 미세 아교 세포,.
Introduction
미세 아교 세포는 중추 신경계의 실질의 감시 대식 세포는 성인 포유류의 뇌의 전체 세포 인구의 약 12 %를 차지. 미세 아교 세포는 난황 주머니 골수 전구 세포에서 유래 및 성인 CNS 1-5에서 다른 cytoarchitectural 지역에서 세포의 밀도와 형태가 다양합니다. 건강한 성인의 뇌에서 미세 아교 세포는 미세 동적 프로세스와, 작은 분지 또는 극성 세포입니다. 그러나, 생체 영상 연구는 미세 아교 프로세스가 동적으로 "를 연상시키는 방식으로 확장하고 자신의 미세 환경을 모니터링 철회 입증, 주변 대식 세포의 형태와는 달리, 미세 아교 세포는 세포 비활성 상태로 나타날 수 있습니다 건강한 두뇌에 대기, 로우 프로파일 표현형을 보여 샘플링 및 "6,7를 조사.
미세 아교 세포는 스위칭, 높은 및 차동 뇌의 환경 및 병태 생리 학적 변화에 반응하는각각 음향 상태 – 일반적으로 자신의 휴식으로 간주하고 활성화 상태에 감시자에서. 정품 인증이 스위치는 병원체 – 관련 분자 패턴에 응답 수신자 같은 수용체 (TLR에), (PAMPS), 즉 세균 및 바이러스 유래 지질 단백질로 막 결합 패턴 인식 수용체 (PRRS)의 결합에 의해 매개 될 수있다 , 핵산, 탄수화물 8-11. PAMPS뿐만 아니라, PRRS는 또한 세포 손상 12-16로 CNS의 항상성에 교란을 나타내는 위험 / 손상 관련 분자 패턴 (감쇠)로 알려진 살균, 비병원성 분자,,에 대해 미세 아교 활성화를 유도하기 위해 표시되었습니다. 일단 종사, PRRS는 미세 아교 세포 형태 및 유전자 발현의 변화가 발생 폭포를 신호 세포를 시작, 특히, 활성화 된 미세 아교 세포는 아메바와 같은 표현형을 적용 세포의 핵에 P65 NF-κB의 서브 유닛 (P65)를 이동시키다, 및 상향 조절 produ의ction의과 반응성 산소 종 (ROS) 16 ~ 24과 함께 종양 괴사 인자-α (TNF-α), 인터루킨-1 β (IL-1β)와 같은 염증성 사이토 카인의 분비. 중추 신경계의 선천성 면역 반응에 필수적인 있지만, 이러한 분비되는 분자는 따라서 파킨슨 병과 알츠하이머 병 25-29로 병에 걸린 상태에서 신경 퇴행을 유발 및 악화, 신경 세포의 산화 스트레스를 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
그러나 병적 인 상태에있는 미세 아교 세포 활성화 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 미세 아교 세포 활성화의 생체 기능의 많은 문화에 효과적으로 요약 할 수있다 따라서, 미세 아교 세포의 분리, 이러한 생물 학적 과정에 강력한 조사 도구입니다. 여러 가지 방법 CNS 조직 (30, 31)의 소화 효소 다음 퍼콜 그라데이션을 통해 격리 등의 미세 아교 세포를 분리 사용할 수 있습니다. 그러나, 소화 효소가 변경할 수 있습니다항원 발현 세포 표면 (32)을 감소하고, 본원에 기재된 방법보다 동물 당 낮은 세포 수율 결과로 세포의 면역 표현형. 이전에 퍼콜 그라데이션 수율 3-5 × 10 5 세포 30,33,34를 통해 전체 CNS에서 격리 방법을보고하면서 구체적으로, 우리는 7.5 × 10 5 세포의 강아지 피질 당 평균 미세 아교 세포의 수율을보고합니다. 본 절차는 이에 소교 면역 표현형 및 기능을 유지, 그들의 낮은 부착 특성에 기초하여 미세 아교 세포를 분리하여, 소화 효소의 사용을 우회.
회전 진탕 기, 이전의 확장에 기계적 교반을 통해, 및 C57BL / 6 쥐의 피질 – 본 연구에서는 신생아 이형 CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + /)에서 파생 된 혼합 된 아교 문화에서 미세 아교 세포의 분리를 설명 발행 방법 24,35. 우리는 미세 아교 세포의 쉬운 시각화를위한 이전의 마우스 변형을 활용,로단핵구 특이 적 프로모터 36-38 -이 마우스는 내인성 Cx3Cr1 궤적의 통제하에 GFP를 표현한다. 이 방법은 보존 면역 표현형 생체 박테리아 지질 다당류 (LPS) 또는 팸 3 CSK 4에 도전 할 때 형태 학적 변화, P65의 핵 전좌, 및 TNF-α의 분비에 의해 설명되는 것과 같이, TLR4와 TLR1 / 2 작용제와 고순도의 미세 아교 문화를 생산 였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 절차는 신생아 쥐에서 대뇌 피질의 미세 아교 세포의 분리를위한 효과적인 방법을 제공합니다. 이 절차는 형광 이미징, 면역 세포 화학 및 ELISA에 의해 결정, 1) 보존 미세 아교 세포의 면역 표현형과 기능의 두 가지 이점을 제공하고, 2) 미세 아교 세포는 이전에 다른 glial 세포 (성상 세포 및 oligodentrocytes)의 존재로 성숙 할 수 있도록 아교 문화의 성숙 기간 동안 중요한 세포 – 세포 상호 작용을 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIEHS R01ES014470 (KMZ)에 의해 지원되었다.
Materials
| Glucose | Sigma | G8270 | Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 °C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM. |
| Sodium pyruvate 100 mM (100x) | Hyclone | SH30239.01 | Store at 4 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM. |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Fetal Bovine Serum (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Minimum Essential Medium Earle's (MEM) | Cellgro | 15-010-CV | Without L-glutamine. Contains Earle's salts. Used to make MCM, MGM, and DM. |
| Horse Serum | Gibco | 16050 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Cellgro | 21-021-CV | Without calcium and magnesium. Store at 4 °C. Used to make MM. |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-031 | Store at 4 °C. Used to make MM. |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | Used to stain cell nucleus. |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1. |
| Rabbit anti-NFκB (p65) | Abcam | 7970 | Used at 1/1250 dilution for ICC staining for p65. |
| Alexafluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11012 | Used at 1/1000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC. |
| 10 ml Disposable Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 50 ml Disposable Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| 15 ml Disposible Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Sterile Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1) | Roboz Surgical | RS-6010 | 1; 5 inch; used for removing head |
| Scissor: Vannas (scissor #2) |
Fine Science Tools | 15000-08 | 1; non-angled; 2.5mm cutting edge; used to open scalp |
| Scissor: Student Vannas (scissor #3) | Fine Science Tools | 91501-09 | 1; curved; used to mince brain tissue |
| Forcep: Dumont #7 (forcep #1) |
Fine Science Tools | 91197-00 | 2; used to secure nose and remove cortices |
| Forcep: Dumont #2 (forcep #2) |
Fine Science Tools | 11223-20 | 1; used to remove scalp |
| Forcep: Dumont #3 (forcep #3) |
Fine Science Tools | 11231-30 | 1; used to remove skull |
| Forcep: Dumont #5a (forcep #4) |
Fine Science Tools | 11253-21 | 1; used to remove meninges |
| Table of specific equipment | |||
| Name of Equipment | Name of Company | Catalogue Number | Comments |
| Zoom Stereo Dissection Microscope | Olympus | SZ4060 | Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet |
| Laminar-Horizontal Flow Cabinet | Nuaire | NU-201-330 | |
| Biological Safety Cabinet | Labconco | 3440001 | Class II |
| Water-Jacketed CO2 Incubator | VWR | 97025-836 | Set to 37 °C, 5% CO2 |
| Swing-out buckets | Fisher Scientific | 75006441 | To be used with Swing-out rotor |
| Swing-out Rotor | Fisher Scientific | 75006445 | Max Radius: 19.2 (cm) |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge (clinical centrifuge) |
Fisher Scientific | 75-004-377 | With swing-out rotor |
| AccuSpin Micro 17 microcentrifuge (tabletop microcentrifuge) |
Fisher Scientific | S98645 | With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524) |
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