Isolering av kortikal Mikroglia med Konserverade immunofenotyp och funktionalitet från Murina Nyfödda
Summary
En nyckel till framgångsrik utredning av microglial biologi är bevarandet av microglial immunofunction ex vivo under isolering från CNS-vävnad. Isolera mikroglia via roterande skakar resultat i mycket rena och immunofunctional cellkulturer som bedöms av fluorescerande imaging, immuncytokemiundersökning och ELISA efter mikroglia aktivering med proinflammatoriska stimuli lipopolysackarid (LPS) och Pam 3 CSK 4 (Pam).
Abstract
Isolering av mikroglia från CNS-vävnad är ett kraftfullt utredningsverktyg som används för att studera microglial biologi ex vivo. Den nuvarande metoden information ett förfarande för isolering av mikroglia från neonatal mus cortex genom mekanisk omrörning med en roterande skak. Denna mikroglia isolering metod ger mycket rena kortikala mikroglia som uppvisar morfologiska och funktionella egenskaper tyder på vilande mikroglia i normala, nonpathological förhållanden in vivo. Detta förfarande bevarar också den microglial immunofenotyp och biokemisk funktion som visas av inducering av morfologiska förändringar, nukleär translokation av p65-subenheten hos NF-kB (p65) och utsöndring av ett kännetecken proinflammatorisk cytokin, tumörnekrosfaktor-α (TNF-α ), på lipopolysackarid (LPS) och Pam 3 CSK 4 (Pam) utmaningar. Därför bevarar immunofenotyp av både vilande och akti föreliggande isoleringsprocedurverad mikroglia, som ger en experimentell metod för att undersöka mikroglia biologi i ex vivo-förhållanden.
Introduction
Mikrogliaceller, övervaknings makrofagerna i CNS parenkym, utgör ungefär 12% av den totala cellpopulationen av den vuxna däggdjurshjärnan. Mikroglia härrör från gulesäcken myeloid precursorceller och varierar i celltäthet och morfologi på olika cytoarchitectural regioner inom den vuxna CNS 1-5. I en frisk vuxen hjärna, mikroglia är små, förgrenade eller polära celler med fina, dynamiska processer. I motsats till perifera makrofager morfologi, mikroglia visar en vilande, låg profil fenotyp i friska hjärnor som kan visas som cellulär inaktivitet, men in vivo imaging studier visar att microglial processer dynamiskt sträcka ut och dra för att övervaka deras mikromiljö på ett sätt som påminner om " provtagning och mätning "6,7.
Mikroglia är starkt och differentiellt lyhörda för miljö-och patofysiologiska förändringar i hjärnan, bytafrån en surveillant till en effektor stats allmänt betraktas som deras vilande och aktiverade stater, respektive. Denna switch i aktivering kan förmedlas genom ingrepp av membranbundna mönsterigenkänningsreceptorer (PRRS), såsom avgiftsliknande receptorer (TLRs), som svarar mot patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs), nämligen bakterie-och virus-härledda lipoproteiner , nukleinsyror och kolhydrater 8-11. Förutom PAMPs har PRRs även visats inducera microglial aktivering mot sterila, icke-patogena molekyler som kallas fara / skada-associerade molekylära mönster (dämpas), som utgör en störning i CNS homeostas, såsom cellskador 12-16. En gång i ingrepp, PRRs initiera en intracellulär signalkaskad som resulterar i förändringar i microglial cellmorfologi och genexpression; specifikt aktiverade mikroglia anpassa en amöboid liknande fenotyp, translokera p65-NF-KB-subenhet (p65) till cellkärnan, och uppreglera produInsatser och utsöndring av proinflammatoriska cytokiner, såsom tumörnekrosfaktor-α (TNF-α), interleukin-1 β (IL-1β), tillsammans med reaktiva syreradikaler (ROS) 16 till 24. Även integrerad i det medfödda immunsvaret i CNS har dessa utsöndrade molekyler även befunnits öka neuronal oxidativ stress och därmed inducera och förvärrar neurodegeneration i sjukdomstillstånd som Parkinsons och Alzheimers sjukdom 25-29.
Emellertid är mekanismen av microglial aktivering i patologiska tillstånd inte helt klarlagd. Därför är isolering av mikroglia ett kraftfullt undersökande verktyg i dessa biologiska processer, så många in vivo funktioner i microglial aktivering kan rekapituleras i kultur. Flera metoder finns tillgängliga för isolering av mikroglia, inklusive isolering via en Percoll gradient efter enzymatisk nedbrytning av CNS-vävnad 30,31. Emellertid kan enzymatisk spjälkning förändraden immunofenotyp av cellerna genom att minska cellyteantigen uttryck 32 och resulterar i lägre cellutbyte per djur än den metod som beskrivs häri. Specifikt rapporterar vi en genomsnittlig mikroglia avkastning per valp cortex av 7,5 x 10 5 celler, medan tidigare rapporterade isoleringsmetoder från hela CNS via en Percoll gradient avkastning 3-5 x 10 5 celler 30,33,34. Det nuvarande förfarandet kringgår användning av matsmältningsenzymer genom att isolera mikroglia baserat på deras låg vidhäftningsförmåga och därmed bevara den microglial immunofenotyp och funktionalitet.
I den aktuella studien beskriver vi isoleringen av mikrogliaceller från blandade gliaceller kulturer härrör från neonatal heterozygota CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -) och C57BL / 6 mus cortex genom mekanisk omrörning på en roterande shaker, en förlängning av tidigare publicerad metod 24,35. Vi utnyttjar det tidigare musstam för enkel visualisering av mikroglia, somDessa möss uttrycker GFP under kontroll av den endogena CX3CR1 locus – en monocyt-specifik promotor från 36 till 38. Denna metod ger högrena microglial kulturer med en bevarad immunofenotyp ex vivo såsom visas genom morfologiska förändringar, nukleär translokation av p65 och utsöndring av TNF-α när de utsattes för bakteriell lipopolysackarid (LPS) eller Pam 3 CSK 4, TLR4 och TLR1 / 2 agonister , respektive.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det nuvarande förfarandet erbjuder en effektiv metod för isolering av kortikala mikroglia från neonatala möss. Detta förfarande har en dubbel nytta av 1) bevara mikroglia immunofenotyp och funktionalitet, som bestäms av fluorescerande imaging, immuncytokemiundersökning och ELISA, samt, 2) låta mikroglia att mogna i närvaro av andra gliaceller (astrocyter och oligodentrocytes) före isolering, som kan underlätta viktiga cell-cell-interaktioner under glial kultur mognadsperiod. Viktigt är isolerade celler visar…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIEHS R01ES014470 (KMZ).
Materials
| Glucose | Sigma | G8270 | Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 °C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM. |
| Sodium pyruvate 100 mM (100x) | Hyclone | SH30239.01 | Store at 4 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM. |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Fetal Bovine Serum (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Minimum Essential Medium Earle's (MEM) | Cellgro | 15-010-CV | Without L-glutamine. Contains Earle's salts. Used to make MCM, MGM, and DM. |
| Horse Serum | Gibco | 16050 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Cellgro | 21-021-CV | Without calcium and magnesium. Store at 4 °C. Used to make MM. |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-031 | Store at 4 °C. Used to make MM. |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | Used to stain cell nucleus. |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1. |
| Rabbit anti-NFκB (p65) | Abcam | 7970 | Used at 1/1250 dilution for ICC staining for p65. |
| Alexafluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11012 | Used at 1/1000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC. |
| 10 ml Disposable Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 50 ml Disposable Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| 15 ml Disposible Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Sterile Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1) | Roboz Surgical | RS-6010 | 1; 5 inch; used for removing head |
| Scissor: Vannas (scissor #2) |
Fine Science Tools | 15000-08 | 1; non-angled; 2.5mm cutting edge; used to open scalp |
| Scissor: Student Vannas (scissor #3) | Fine Science Tools | 91501-09 | 1; curved; used to mince brain tissue |
| Forcep: Dumont #7 (forcep #1) |
Fine Science Tools | 91197-00 | 2; used to secure nose and remove cortices |
| Forcep: Dumont #2 (forcep #2) |
Fine Science Tools | 11223-20 | 1; used to remove scalp |
| Forcep: Dumont #3 (forcep #3) |
Fine Science Tools | 11231-30 | 1; used to remove skull |
| Forcep: Dumont #5a (forcep #4) |
Fine Science Tools | 11253-21 | 1; used to remove meninges |
| Table of specific equipment | |||
| Name of Equipment | Name of Company | Catalogue Number | Comments |
| Zoom Stereo Dissection Microscope | Olympus | SZ4060 | Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet |
| Laminar-Horizontal Flow Cabinet | Nuaire | NU-201-330 | |
| Biological Safety Cabinet | Labconco | 3440001 | Class II |
| Water-Jacketed CO2 Incubator | VWR | 97025-836 | Set to 37 °C, 5% CO2 |
| Swing-out buckets | Fisher Scientific | 75006441 | To be used with Swing-out rotor |
| Swing-out Rotor | Fisher Scientific | 75006445 | Max Radius: 19.2 (cm) |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge (clinical centrifuge) |
Fisher Scientific | 75-004-377 | With swing-out rotor |
| AccuSpin Micro 17 microcentrifuge (tabletop microcentrifuge) |
Fisher Scientific | S98645 | With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524) |
References
- Ranshoff, R. M. P. V. H. Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neurosciences. 39, 151-170 (1990).
- Gomez Perdiguero, E., Schulz, C., Geissmann, F. Development and homeostasis of "resident" myeloid cells: The case of the microglia. Glia. 61, 112-120 (2013).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat. Neurosci. 16, 273-280 (2013).
- Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nature reviews. Immunology. , 11-775 (2011).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Hu, S., et al. Cytokine and free radical production by porcine microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 78, 93-96 (1996).
- Muzio, M., Polentarutti, N., Bosisio, D., Prahladan, M. K., Mantovani, A. Toll-like receptors: a growing family of immune receptors that are differentially expressed and regulated by different leukocytes. J. Leukocyte Biol. 67, 450-456 (2000).
- Lee, S. J., Lee, S. Toll-like receptors and inflammation in the CNS. Curr. Drug Targets. Inflamm. Allergy. 1, 181-191 (2002).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8, 57-69 (2007).
- Halle, A., et al. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-beta. Nat. Immunol. 9, 857-865 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Duewell, P., et al. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals. Nature. 464, 1357-1361 (2010).
- Stewart, C. R., et al. CD36 ligands promote sterile inflammation through assembly of a Toll-like receptor 4. 11, 155-161 (2010).
- Beraud, D., et al. alpha-Synuclein Alters Toll-Like Receptor Expression. Front. Neurosci. 5, 80 (2011).
- Banati, R. B., Gehrmann, J., Schubert, P., Kreutzberg, G. W. Cytotoxicity of microglia.. Glia. 7, 111-118 (1993).
- Combs, C. K., Karlo, J. C., Kao, S. C., Landreth, G. E. beta-Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNF alpha-dependent expression of induciblenitric oxide synthase and neuronal apoptosis. J. Neurosci. 21, 1179-1188 (2001).
- Kim, Y. S., Joh, T. H. Microglia, major player in the brain inflammation: their roles in the pathogenesis of Parkinson’s disease. Exp. Mol. Med. 38, 333-347 (2006).
- Colton, C., Wilcock, D. M. Assessing activation states in microglia. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 174-191 (2010).
- Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Ceramide activates microglia to enhance the production/secretion of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) without induction of deleterious factors in vitro. J. Neurochem. 80, 697-705 (2002).
- Uesugi, M., Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Nonparticipation of nuclear factor kappa B (NFkappaB) in the signaling cascade of c-JunN-terminal kinase (JNK)- and p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)-dependent tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) induction in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated microglia. Brain Res. , 1073-1074 (2006).
- Beraud, D., et al. Microglial Activation and Antioxidant Responses Induced by the Parkinson’s Disease Protein alpha-Synuclein. J. Neuroimmun. Pharmacol. 8, 94-117 (2013).
- Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson’s disease. Neurobiol. Aging. 29, 1690-1701 (2008).
- Minghetti, L., Levi, G. Microglia as effector cells in brain damage and repair: focus on prostanoids and nitric oxide. Prog. Neurobiol. 54, 99-125 (1998).
- Hirsch, E. C. Glial cells and Parkinson’s disease. J. Neurol.. 247 (2), 58-62 (2000).
- Liu, B., et al. Role of nitric oxide in inflammation-mediated neurodegeneration. Ann. NY Acad. Sci. 962, 318-331 (2002).
- Shie, F. S., Nivison, M., Hsu, P. C., Montine, T. J. Modulation of microglialinnate immunity in Alzheimer’s disease by activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Curr. Med. Chem. 16, 643-651 (2009).
- Rogers, J., Mastroeni, D., Leonard, B., Joyce, J., Grover, A. Neuroinflammation in Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease: are microglia pathogenic in either disorder. Int. Rev. Neurobiol. 82, 235-246 (2007).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murinemicroglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
- Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression. J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).
- Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J. Vis. Exp. , (2011).
- Veremeyko, T., Starossom, S. C., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. Detection of microRNAs in microglia by real-time PCR in normal CNS and during neuroinflammation. J. Vis. Exp. , (2012).
- Su, X., Federoff, H. J., Maguire-Zeiss, K. A. Mutant alpha-synuclein overexpression mediates early proinflammatory activity. Neurotox. Res. 16, 238-254 (2009).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptorCX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Imai, T., et al. Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion. Cell. 91, 521-530 (1997).
- Cardona, A. E., et al. Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor. Nat. Neurosci. 9, 917-924 (2006).
- Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57, 563-581 (1999).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus:immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
