Isolement et culture de cellules endothéliales de la embryonnaire du cerveau antérieur

Résumé

Cette vidéo montre une stratégie simple et fiable pour la préparation de cultures pures de cellules endothéliales de cerveau antérieur embryonnaire dans les 10-12 jours et sera utile pour la recherche axée sur de nombreux aspects de l'angiogenèse cérébrale.

Résumé

Cellules endothéliales du cerveau embryonnaires peuvent servir comme un outil important dans l'étude de l'angiogenèse et le développement neuro-vasculaire et les interactions. Les deux réseaux vasculaires du cerveau antérieur embryonnaire, la pie-mère et périventriculaire, sont distinctes dans l'espace et avoir des origines différentes et des modèles de croissance. Les cellules endotheliales à partir des réseaux vasculaires et la pie-mère périventriculaires ont des profils uniques d'expression génique et les fonctions. Nous présentons ici un protocole étape par étape pour l'isolement, la culture, et la vérification des populations pures de cellules endothéliales à partir du réseau vasculaire périventriculaire (PVECs) du cerveau antérieur embryonnaire (télencéphale). Dans cette approche, le télencéphale dépourvue de membrane pial obtenu à partir de 15 jours embryonnaires de souris est hachée, une digestion avec de la collagénase / dispase, et on disperse mécaniquement dans une suspension cellulaire unique. PVECs sont purifiés à partir de la suspension cellulaire en utilisant une sélection positive avec l'anticorps conjugué à anti-CD-31/PECAM-1 microbilles en utilisant une forte magnétiqueProcédé de séparation. Des cellules purifiées sont cultivées sur collagène 1 boîtes de culture revêtues dans endothéliale milieu de culture de cellules jusqu'à confluence, et en outre en subculture. PVECs obtenu avec ce protocole exposition pavé et en forme de fuseau phénotypes, comme visualisé par microscopie optique à contraste de phase et microscopie de fluorescence. Pureté des cultures Pvec a été créée avec des marqueurs de cellules endothéliales. Dans nos mains, cette méthode fiable et cohérente donne des populations pures de PVECs. Ce protocole bénéficiera des études visant à obtenir un aperçu mécanistes dans le cerveau antérieur angiogenèse, la compréhension des interactions de Pvec et croisées des entretiens avec les types de cellules neuronales et détient un énorme potentiel pour l'angiogenèse thérapeutique.

Introduction

L'angiogenèse, la neurogenèse et la migration neuronale sont des événements critiques dans le système nerveux central (SNC) le développement, la réparation et la régénération. Plusieurs études ont montré que les élégantes cellules endothéliales stimulent la prolifération neuronale et vice-versa grâce à la libération de facteurs solubles et par contact direct. Nous avons trouvé curieux que dans la majorité de ces études ^1-3, tandis que progéniteurs neuronaux / cellules souches neurales sont isolées du cerveau embryonnaire, ils sont co-cultivées avec des cellules endothéliales de cerveau de l'adulte, d'autres sources de tissu adulte, ou avec des ....

Protocole

Une. Préparation des réactifs et solutions

1. Revêtement de 35 mm boîte de culture: Le collagène de type 1 est fournie comme solution une solution aqueuse à 20 mM d'acide acétique (~ 100 mg de protéine / fiole). Diluer un volume approprié de solution de collagène à une concentration de travail de 0,01% en utilisant une culture tissulaire stérile eau de qualité. plats Manteau avec 1 ml de solution de collagène pour 3-4 heures à température ambiante (RT) ou 37 ° C, ou une nuit à 2-8 ° C. Enlever l'excédent de la boîte enduit et laisser sécher pendant la nuit. Rincer le plat avec de l'eau de qualité de culture de tissus ou de PBS avant d'ajouter ....

Résultats

La caractérisation phénotypique des PVECs du jour 1-12 est représenté par microscopie optique à contraste de phase (Figure 2). Les cellules fixées à l'antenne le jour 1 montrent une morphologie caractéristique de la division cellulaire (figure 2A). Entre 5-8 jours, PVECs transition de galets de pierre à la broche en forme de morphologie typique des cellules endothéliales et plus proche de son état ​​in vivo (figures 2B et 2C). Par jour 12 d.......

Discussion

Pvec de sont physiologiquement plus pertinent que les cellules endothéliales cérébrales adultes et EC provenant d'autres sources de tissus pour des études portant sur les interactions neurovasculaires et avoir un potentiel thérapeutique aussi. Pour la préparation PVEC, il est essentiel début à la dissection de travailler rapidement pour obtenir une bonne viabilité puisque les cellules mortes peuvent se lier de manière non spécifique à microbilles CD31. En outre, si la suspension à cellule unique n'est pas attein.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DNase I	Sigma	D-4527	;
Collagène, solution de type 1 de queue de rat  ;	Sigma	C3867	;
Produits biologiques de qualité	DPBS	114057-131	;
EDTA	Fisher Scientific	M4055	² ;
BSA	Sigma	A2058	;
MS column	Miltenyi Biotech	130-042-201	;
Microbilles CD31	Miltenyi Biotech	130-097-418	;
Séparateur MACS	Miltenyi Biotech	130-042-102	;
Stand multiple MACS	Miltenyi Biotech	130-042-303	;
Crépine à cellules 70 µ ; m	BD Bioscience	352350	;
Solution antibiotique et antimycosique	Sigma	A5955	²�
FBS	Sigma	F4135	² ;
Collagenase/Dispase	Roche	10269638001	;
DMEM  ;	Lonza	12-604F	;
Plat de culture 35 mm	BD Bioscience	353001	;
Tube Falcon de 15 ml  ;	BD Bioscience	352097
50 ml Tube Falcon	BD Bioscience	352098	;
Kit ECCM	Le kit 355054 BD Bioscience		comprend un supplément de croissance des cellules endothéliales, un EGF et un supplément
croissance des cellules endothéliales (ECGS)	Bioscience	354006	;
Applications des cellules	RBECGM	R819-500	;
DMEM F12° ;	Life Technologies	10565-018	;
GlutaMAX	Life Technologies	305050-061	;
Eau de culture tissulaire Life	Technologies	15230162	;
0,25 % Trypsine Life	Technologies	15050	;
Inhibiteur de la trypsine de soja	BD Bioscience	5425	;
Matrigel	BD Bioscience	354234	;
Qtracker 655 Kit d’étiquetage cellulaire	Life Technologies	Q25021	;
Membrane plasmique CellLight-RFP, BacMam 2.0	Life Technologies	C10608	;
Anticorps biotinylé contre l’isolectine B4	Sigma	L2140	;
Facteur anti-Von Willebrand	Sigma	F3520	;
Anti-CD31/PECAM-1	BD Pharmingen	550274	;
Supports de montage VECTASHIELD Hardset avec DAPI	Vector Laboratories	H-1500	;
Kétamine	Butler Schein Approvisionnement en santé animale	44028	;
Xylazine	Lloyd Laboratories	1009	;
Stéréomicroscope	Motic	SMZ-168	;
Hémocytomètre	Fisher Scientific	267110	;
Microscope inversé	Olympus CK-40	CK-40	;
Microscope fluorescent	Olympus FSX-100	FSX-100	;
Pince fine	Roboz Instrument chirurgical	7 inox	;
Ciseaux fins à micro-pointes	Roboz Surgical Instrument	RS5611	;

de inhibiteur de la trypsine de sojaBD