<em> Xenopus</em> טכניקת ביצית Cut-פתוח וזלין גאפ מתח מהדק עם Fluorometry
Summary
גישת פער זלין החתך פתוח משמשת להשגת הקלטות רעש נמוכות של זרמים יוניים וgating מתעלות יונים מתח תלוי מבוטאים בביציות Xenopus עם רזולוציה גבוהה של קינטיקה ערוץ מהר. עם שינוי קל, fluorometry מהדק מתח יכול להיות מצמידים את פרוטוקול ביצית החתך פתוח.
Abstract
פער זלין ביצית החתך פתוח (COVG) טכניקת מהדק מתח מאפשרת ניתוח של מאפייני אלקטרו והקינטית של תעלות יונים Heterologous בביציות. הקלטות מהגדרת החתך פתוח הן שימושיות במיוחד לפתרון זרמים נמוכים gating הגודל, הפעלה נוכחית יונית מהירה, ושחרור משרות. היתרונות העיקריים על פני מהדק מתח שתי אלקטרודות טכניקה (TEVC) כוללים מהירות מוגברת מהדק, יחס אות לרעש משופר, והיכולת לווסת את תאית וסביבה תאית.
כאן, אנחנו מעסיקים ערוץ נתרן לב האנושי (HNA V 1.5), הביע ב ביציות Xenopus, כדי להדגים את הגדרת החתך פתוח ופרוטוקול, כמו גם שינויים דרושים כדי להוסיף את יכולת fluorometry מהדק מתח.
המאפיינים של ערוצים מהירים להפעלת יון, כגון HNA V 1.5, לא ניתן לפתור באופן מלא ליד טמפרטורת חדר באמצעות TEVC, באשרשעות השלמות של קרום הביצית הוא הידק, מה שהופך את בקרת מתח קשה. עם זאת, בטכניקת החיתוך פתוח, בידוד של רק חלק קטן מקרום התא מאפשר להידוק המהיר יידרש לרשום במדויק קינטיקה מהירה תוך מניעת ערוץ מוזנח הקשורים לטכניקות תיקון מהדק.
בשילוב עם טכניקת COVG, קינטיקה ערוץ יון ומאפייני אלקטרו ניתן assayed נוסף באמצעות fluorometry מהדק מתח, שבו תנועת חלבון היא מעקב באמצעות נטיית ציסטאין של fluorophores מיושם extracellularly, החדרה של חלבוני ניאון מקודדים גנטי, או שילוב של חומצות אמינו לא טבעיות לאזור של עניין 1. נתונים נוספים זה מניב מידע קינטית על שחלופי קונפורמציה מתח תלוי של החלבון באמצעות שינויים בmicroenvironment המקיף את מולקולת הניאון.
Introduction
טכניקות הידוק מתח מיוחדות תאפשר ההקלטה של זרמים יוניים בפוטנציאל קרום מבוקר. שימוש נרחב מהדק שתי אלקטרודות מתח (TEVC) וטכניקות תיקון מהדק לספק מידע אלקטרו אמין על המאפיינים של תעלות יונים רבות. עם זאת, שתי שיטות אלה יש חסרונות שמונעים הרכישה של נתונים מהימנים לערוצים במהירות מתח מגודרת נתרן וערוצים להפעלה מהירה אחרים בממברנות כגון אלה של ביציות Xenopus. מעבדות Bezanilla וסטפאני וכתוצאה מכך פיתחו את טכניקת החיתוך פתוח מהדק מתח פער זלין (COVG) לביציות 2. הטכניקה כבר מיושמת באופן נרחב כדי להקליט, Na +, K +, וCa 2 ערוצים + 3-8.
במהלך הקלטת COVG, קרום ביצית-לבטא חלבון Heterologous מחולק לשלושה אזורים. הנתונים הנוכחיים היוניים נרשם מהאזור העליון של הביצית כאמבטיה המקיפה את האזור העליון מהודקת לפוטנציאל פקודה, אשר ניתן לשנות בקלות ובמהירות. האזור האמצעי שומרים נגד זרמי זליגה על ידי שהדק את אותו פוטנציאל כמו של האזור העליון 9. האזור התחתון הוא שבו פתיחת ביצית (לחתוך פתוח) מתרחשת באמצעות השימוש בפתרון saponin או צינורית. כימי או פתיחה ידנית של הקרום באזור התחתון מאפשרת שליטה של הפוטנציאל הפנימי, שהוא הידק לאדמה, והופך את רציף התא הפנימי עם פתרון התא התחתון. טפטוף של פתרונות לתא התחתון ניתן להתאים את המאפיינים של הסביבה הפנימית, ואילו מטבע פתרון בתא העליון משנה את הסביבה החיצונית. 
איור 1. ביצית Cut-Open תרשים התקנת מתח-קלאמפ אמבט. () למעלהלמטה תצוגה של שלוש האמבטיות מופרדות אחד מהשני. ממדיהם של התאים לCOVG מוצגים באיור. (ב) להציג צד של התקנת האמבטיות בעמדת בדיקה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
היתרונות של טכניקת COVG כוללים רעש נמוך הנוכחי (1 NA ב3 קילוהרץ), שליטה על הרכב היוני של מדיה החיצונית, היכולת לווסת את התקשורת הפנימית, ברזולוציה זמן מהיר (20-100 המתמיד של דעיכה של μsec זמן קיבולת חולפת), והקלטות יציבים במשך כמה שעות 9. החסרונות הם שזה דורש ציוד מיוחד וקשה יותר לביצוע בהשוואה לשני הידוק מתח האלקטרודה (TEVC) 10.
בעוד גישת COVG דורשת ציוד מיוחד מאוד ואלמנטים פרוצדורליים מורכבים, זה יכול לאפשר לרכישת valuנתונים אלקטרו מסוגלים. נתונים אלה, כגון gating זרמים עם קינטיקה מהירה וזרמי זנב 4, ניתן להקליט בלי חלק מהנושאים הקשורים לפרוטוקולי הידוק מתח אחרים, כולל ערוץ מוזנח. שינויים קלים להתקנת COVG יכולים לאפשר את השימוש בבקרי הטמפרטורה וfluorometry מהדק מתח (VCF). הכללתם של אלמנטי fluorometry מהדק מתח בתוך ההרכבה COVG יכול להגדיל את תפוקת נתונים על ידי המקנה את היכולת לעקוב אחר שינויי קונפורמציה חלבון בעת הקלטת 11-13 הנוכחי בו זמנית.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכניקת מהדק החתך פתוח וזלין ביצית מתח פער מאפשרת פתרון מהיר של נתונים, רעש נמוך, שליטה מוגברת על פתרון פנימי והרכב פתרון חיצוני, והקלטות יציבים לאורך פרוטוקולים ארוכים יחסית 19. יתרונות אלה שנקבעו בטכניקה זו מלבד המהדק הסטנדרטי שתי אלקטרודות מתח וטכניקות תיקון ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
כל החברים של אוניברסיטת וושינגטון במעבדה להנדסה מולקולרית לב סנט לואיס. בורוז ברוכים קרן פרס קריירה בממשק המדעי – 1010299 (לJS).
Materials
| External Solution | Brand | Catalog Number | [Final], weight, or volume |
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 25mM |
| MES Sodium Salt | Sigma-Aldrich | M5057 | 90mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 20mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | variable (pH to 7.4) |
| Internal Solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 105mM |
| MES Sodium Salt | Sigma-Aldrich | M5057 | 10mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 20mM |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | 2mM |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | variable (pH to 7.4) |
| Depolarizing Solution | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | 221473 | 110mM |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | 1.5mM |
| Calcium Chloride | Caisson | C021 | 0.8mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 10mM |
| Pipet Solution | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | 221473 | 3M |
| Saponin Solution | |||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | 0.125g |
| Internal Solution | See above | 50mL | |
| Agar Bridge Solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 100ml of 1M |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 1.2g |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | variable (pH to 7.4) |
| Granulated Agar | Research Products International | A20250 | 3% |
| NMDG Storage Solution | |||
| NMDG, HEPES, MES Hydrate solution | see above | 40ml | |
| Water | 60ml | ||
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| High Performance Oocyte Clamp | Dagan | CA-1B | |
| Data Acquisition System | Axon CNS | Digidata 1440A | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 210 | |
| Rack Power Filter | APC | G5 | |
| Heating/Cooling Bath Temperature Controller | Dagan | HCC-100A | |
| PC | Dell | Optiplex 990 | |
| pCLAMP 10.3 Voltage Clamp Software | Molecular Devices, LLC | pCLAMP10.3 | |
| TMC Vibration Control TableTop Platform | TMC | 64 SERIES | |
| TMC Vibration Control Air Table | TMC | 20 Series | |
| V1/I Electrode Data Collector | Dagan | part of CA-1B | |
| MX10L Micromanipulator | Siskiyou | MX10L | |
| Bath/Guard (I/V) Headstage (with appropriate connectors) | Dagan | part of CA-1B | |
| Microscope | Omano | OM2300S-JW11 | |
| Temperature Control Bath | Custom or Dagan | Custom or HE-204C | Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). Dagan also provides a prefeabricated stage (HE-204C). |
| Custom AgCl Pellet Container | Custom | Custom | Custom machined |
| Ag/AgCl electrode, pellet, 2.0 mm | Warner | E-206 | |
| External Oocyte Bath | Custom or Dagan | Custom or CC-1-T-LB | Custom machined or purchased from Dagan |
| Internal Oocyte Bath | Custom or Dagan | Custom or CC-TG-ND | Custom machined or purchased from Dagan |
| Capillaries for Agar Bridges and Pulled Electrodes | Warner | G150T-4 | |
| Rotatable Mounts for the Microscope, Micromanipulator, and Bath | Siskiyou | SD-1280P | |
| Fiber-Lite | Dolan-Jenner | LMI-600 | |
| Regular Bleach | Clorox | 470174-764 | |
| Xenopus laevis Oocytes | Nasco | LM535M (sexually mature females) | |
| 90 Na+ External Solution | See Solutions sheet | ||
| 10 Na+ Internal Solution | See Solutions sheet | ||
| 3 M KCL | See Solutions sheet | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| NMDG Storage Solution | See Solutions sheet | ||
| 5mL transfer pipets | SciMart | GS-52 | |
| Modified KCl electrode injector | BD | 309659 | Plastic syringe tip melted to allow for injection of solution into electrodes. Alternatively, a Microfil by WPI can be purchased. |
| Microvaccum | Custom | Custom | |
| Forceps | VWR | 63040-458 | |
| Oocyte Handling Tools (Pipette Pump) | VWR | 53502-222 | |
| Deionized Water Squirt Bottle | VWR | 16649-911 | |
| Vaseline Petroleum Jelly | Fisher Scientific | 19-086-291 | |
| Additional Materials Required for VCF Recordings: | |||
| VCF Microscope | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Nikon CFI APO 40XW NIR Objective | Nikon | N40X-NIR | |
| X-Y Translator System for Fixed-Stage Upright Microscopes | Sutter Instruments | MT500-586 | |
| External VCF Oocyte Bath | Custom | Custom machined. The chamber dimensions are 2.7 x 1.9 x 0.4 cm. | |
| Internal VCF Oocyte Bath | Custom | Custom machined. The chamber dimensions are 1.6 x 1.6 x 0.4 cm. | |
| Modified Temperature Control Bath | Custom | Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). The chamber dimensions of the modified temperature controller bath are 2.7 x 1.9 x 0.3 cm for the horizontal chamber, and 1 x 2.5 x 0.5 cm for the vertical chamber. |
References
- Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in KV channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8272-8277 (2013).
- Stefani, E., Bezanilla, F. Cut-open oocyte voltage-clamp technique. Methods Enzymol. 293, 300-318 (1998).
- Muroi, Y., Chanda, B. Local anesthetics disrupt energetic coupling between the voltage-sensing segments of a sodium channel. J. Gen. Physiol. 133, 1-15 (2009).
- Stefani, E., Toro, L., Perozo, E., Bezanilla, F. Gating of Shaker K+ channels: I. Ionic and gating currents. Biophys. J. 66, 996-1010 (1994).
- Wang, S., Liu, S., Morales, M. J., Strauss, H. C., Rasmusson, R. L. A quantitative analysis of the activation and inactivation kinetics of HERG expressed in Xenopus oocytes. J. Physiolt. 502 (Pt 1), 45-60 (1997).
- Neely, A., Garcia-Olivares, J., Voswinkel, S., Horstkott, H., Hidalgo, P. Folding of active calcium channel beta(1b) -subunit by size-exclusion chromatography and its role on channel function. J. Biol. Chem. 279, 21689-21694 (2004).
- Silva, J. R., Goldstein, S. A. Voltage-sensor movements describe slow inactivation of voltage-gated sodium channels I: wild-type skeletal muscle. Na(V)1.4. J. Gen. Physiol. 141, 309-321 (2013).
- Silva, J. R., Goldstein, S. A. Voltage-sensor movements describe slow inactivation of voltage-gated sodium channels II: a periodic paralysis mutation in Na(V)1.4 (L689I). J. Gen. Physiol. 141, 323-334 (2013).
- Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes. Biophys. J. 61, 78-82 (1992).
- Clare, J. J., Trezise, D. J. . Expression and analysis of recombinant ion channels : from structural studies to pharmacological screening. , (2006).
- Cha, A., Zerangue, N., Kavanaugh, M., Bezanilla, F., Susan, G. A. . Methods in enzymology. 296, 566-578 (1998).
- Lakowicz, J. R. . Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd edn. , (2006).
- Cha, A., Bezanilla, F. Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence. Neuron. 19, 1127-1140 (1997).
- Richards, R., Dempski, R. E. Examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling. J. Vis. Exp. , (2011).
- Cohen, S., Au, S., Pante, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. J. Vis. Exp. , (2009).
- Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. The silver-silver chloride electrode: a possible generator of offset voltages and currents. J. Neurosci. Methods. 19, 249-255 (1987).
- Gagnon, D. G., Bissonnette, P., Lapointe, J. Y. Identification of a disulfide bridge linking the fourth and the seventh extracellular loops of the Na+/glucose cotransporter. J. Gen. Physiol. 127, 145-158 (2006).
- Pantazis, A., Olcese, R., Roberts, G. . Cut-Open Oocyte Voltage-Clamp Technique. In: Roberts G. (Ed.) Encyclopedia of Biophysics: SpringerReference. , (2013).
