التصوير InlC إفراز المعنية بالتحقيق في العدوى البكتيرية الخلوية من قبل الممرض<em> المستوحدة الليستيريا</em
Summary
المستوحدة الليستيريا هو الممرض الجرثومي موجبة الجرام كثيرا ما تستخدم كنموذج رئيسي لدراسة التطفل داخل الخلايا. التصوير أواخر L. المستوحدة مراحل العدوى في سياق شاشات الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة يسمح للدراسة عالمية من مسارات الخلوية اللازمة لعدوى بكتيرية من الخلايا المضيفة الهدف.
Abstract
يمكن تصور مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا الجزيئية كأدوات لتشريح شلالات الإشارات الخلوية وذلك بسبب قدرتها على التعامل بشكل رائع وتخريب وظائف الخلية التي هي المطلوبة لإصابة الأنسجة المستهدفة المضيف. بين هذه الجراثيم البكتيرية، المستوحدة الليستيريا هو الكائنات الحية الدقيقة موجبة الجرام التي تم استخدامها كنموذج للالتطفل داخل الخلايا في توصيف الاستجابات المناعية الخلوية، والتي لعبت أدوارا مفيدة في اكتشاف مسارات الجزيئية التي تتحكم في هيكل الخلية وغشاء ديناميات الاتجار. في هذه المقالة، ونحن تصف فحص مجهري قوية للكشف عن المراحل المتأخرة من العدوى الخلوية L. المستوحدة على أساس وضع العلامات الفلورية من InlC، وهو بروتين يفرز البكتيريا التي تتراكم في السيتوبلازم من الخلايا المصابة، ويمكن أن يقترن هذا الفحص للمشاريع الصغيرة بالتدخل RNA شاشات عالية الإنتاجية الآلي من أجل شارacterize مسارات الإشارات الخلوية المشاركين في أعلى أو أسفل التنظيم من العدوى.
Introduction
البكتيريا موجبة الجرام المستوحدة الليستيريا هو الممرض المنقولة عن طريق الأغذية التي تغزو الخلايا المضيفة، يعطل فجوة الداخلي ويتكاثر في سيتوبلازم الخلايا المضيفة 1. L. المستوحدة سهولة التلاعب في سياق مختبر (النمو السريع، وسمية منخفضة بالنسبة للأفراد الأصحاء) المرتبطة استمرار الصفات الفوعة البكتيرية التي لوحظت في النماذج الخلوية والحيوانية (النشاط الانحلالي، زيادة عدد الكريات البيضاء) يسمح استخدام الأولي في 1960s كنموذج رئيسي ل دراسة التطفل داخل الخلايا ولإنشاء الأسس النظرية من المناعة الخلوية ضد العدوى 2. في أواخر 1980s وأوائل 1990s، وتشريح الخلايا البكتيرية دورة 3 وكذلك التوصيف الجزيئي للبكتيريا الفوعة أهم عوامل 4-7 يفضل استخدام L. المستوحدة كأداة جزيئية أساسية للتلاعب وعشيقذ من وظائف الخلية المضيفة. وجود الفوعة (L. innocua) وخبيثة (المستوحدة L.) الأنواع في جنس الليستيريا مهدت الطريق لدراسات الجينوم المقارن 8 التي، جنبا إلى جنب مع إنشاء الأخيرة لL. كاملة المستوحدة Transcriptome على 9، زادت فهمنا للتطور L. المستوحدة كما الممرض الإنسان وكنظام نموذج للعدوى يدرس 10.
المستوحدة L. يدفع تدخيل حيز الخلايا المضيفة على تفاعل البروتينات السطحية البكتيرية InlA وInlB مع مستقبلات الخلايا المضيفة E-كادهيرين والتقى على التوالي 11-12. أدت الدراسات القائمة على المرشح الأولي لتحديد الرابط catenins-الأكتين α / β باعتبارها عنصرا هاما من مسار InlA الغزو و13 من فسفوإينوزيتيد 3 كيناز (PI 3-K) باعتباره المستجيب تنتقد InlB- تعتمد الغزو كاسكادي 14-15. يسمح فحوصات البروتين ومقرها ظيفية في وقت لاحق تحديد عناصر هيكل الخلية رواية 16 ورسله الثانية من المادة الدهنية 17 المطلوبة لغزو الخلية المضيفة. وتسلط الدراسات النسخي 18 و المستندة إلى مطياف الكتلة الكمي البروتيوميات 19 مؤخرا ضوءا جديدا بشأن تفعيل المضيف يشير شلالات وقمع الاستجابات المناعية خلال L. المستوحدة العدوى. نهج بيولوجيا النظم القائمة على تعطيل مجموعات كبيرة من الجينات (kinomes، الجينوم الكامل) عن طريق الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (سيرنا) إسكات قد فتحت مؤخرا آفاقا جديدة لتحليل المضيف العالمية يشير شلالات في سياق الوظائف الخلوية محددة، بما في ذلك البلعمة و الممرض استيعاب 20. شاشات سيرنا على نطاق الجينوم وقد أجريت سابقا للتحقيق شلالات الخلوية اللازمة لإصابة L. المستوحدة في أكلة ذبابة الفاكهة </eم> خلايا S2 21-22، ولكن لم يتم تنفيذ هذا النوع من التحليل في الخلايا غير البلعمية، والتي تمثل أهدافا حاسمة للعدوى في الجسم الحي.
لدينا بروتوكول الأمثل للكشف المجهري من المراحل المتأخرة من العدوى عن طريق L. المستوحدة التي تناسب دراسات الإنتاجية العالية سيرنا من دخول البكتيريا داخل الخلايا الظهارية. لدينا فحص يستفيد من L. الغازية للغاية المستوحدة السلالة التي يمثل طفرة نقطة في PrfA، المنظم الرئيسي للالنسخي L. المستوحدة عوامل الفوعة 6: هذه الطفرة (اسمه PrfA *) يجعل PrfA نشطة جوهري 23 ويؤدي إلى زيادة تعبير من البروتينات الغزو InlA وInlB، وبالتالي تفضيل دخول البكتيريا في الخلايا غير المصابة إلا أكلة سيئة. ويستند لدينا قراءات للعدوى على الكشف عن تراكم عصاري خلوي من البروتين يفرز البكتيرية InlC: هذا هو جزيءوالمستجيب عديد المظاهر التي يعبر عنها بشكل تفضيلي من قبل داخل هيولي L. المستوحدة 9 والتي تشارك ليس فقط في الخلية الخلية الى البكتيرية تنتشر 24 ولكن الذي ينظم أيضا المضيف الاستجابات المناعية 25. وضع العلامات الفلورية إفراز InlC من البكتيريا داخل الخلايا يسمح ليس فقط لتميز بوضوح المصابة من الخلايا غير المصابة، ولكن أيضا يمثل قراءات نقطة النهاية التي يمكن استخدامها في وقت لاحق لتشريح العدوى في خطواتها مختلفة: الدخول، والهروب فجوي، عصاري خلوي البكتيرية انتشار وانتشار الخلية الى خلية. يمكن أن يقترن هذا البروتوكول القائم على الفحص المجهري لشاشات سيرنا بالتالي لدراسة مسارات الخلوية تشارك في إصابة الخلايا المضيفة التي كتبها L. المستوحدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
العديد من المعلمات حاسمة لنجاح لدينا بروتوكول InlC الكشف، بما في ذلك استخدام خطوط الخلايا السليمة عرض على السيتوبلازم كبيرة بما فيه الكفاية للسماح الكشف لا لبس فيه للإشارة InlC. في مقايسة نقدم في هذه المقالة نقترح استخدام خلايا هيلا CCL2، والتي هي مناسبة بشكل خاص لفحص لدي?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم البحوث في المختبر P. Cossart من قبل معهد باستور، والمعهد الوطني للسانتيه آخرون دي لا بحوث MEDICALE، والمعهد الوطني للبحوث الزراعية لا، ERC المتقدم المنحة (233348)، والوكالة الوطنية دي لا بحوث (المنحة النثريات- SignRupVac)، ومؤسسة لويس Jeantet ومؤسسة روش لو ليه Mousquetaires. AK هو حاصل على منحة دراسية من جامعة باستور باريس الدولي الدكتوراه البرنامج / معهد كارنو علل Infectieuses. نشكر جيسون ميرسر لتحسين بروتوكول ترنسفكأيشن الخلوية.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bacto Brain Heart Infusion | BD | 237500 | For liquid BHI preparation |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Supplement to liquid BHI for BHI agar plates |
| Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Biowest | 51830-500 | |
| DMEM | Invitrogen | 61965-026 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-100 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397-10ML | |
| Formaldehyde (16%) | EMS | 15710 | Prepare fresh before each experiment |
| Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A-11035 | |
| DAPI | Invitrogen | D-1306 | |
| Phalloidin Dy647 | Dyomics | 647-33 | |
| siRNA Scramble | Dharmacon | D-001810-10 | |
| siRNA Met | Dharmacon | L-003156-00-0005 | |
| Black 384-well microscopy cell culture plate | Corning | 3985 | |
| AxioObserver Z1 microscope | Zeiss | 431007 9901 | |
| sCMOS camera | Andor | Neo | |
| Metamorph analysis software | Molecular Devices | 4000 | |
| CellProfiler analysis software | Broad Institute | Public software available at http://www.cellprofiler.org/ |
References
- Pizarro-Cerdá, J., Kühbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).
- Mackaness, G. B. Cellular resistance to infection. Journal of Experimental Medicine. 116, 381-406 (1962).
- Tilney, L. G., Portnoy, D. A. Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes. Journal of Cell Biology. 109, 1597-1608 (1989).
- Mengaud, J., Chenevert, J., Geoffroy, C., Gaillard, J. L., Cossart, P. Identification of the structural gene encoding the SH-activated hemolysin of Listeria monocytogenes: listeriolysin O is homologous to streptolysin O and pneumolysin. Infection and Immunity. 55, 3225-3227 (1987).
- Gaillard, J. L., Berche, P., Frehel, C., Gouin, E., Cossart, P. Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci. Cell. 65, 1127-1141 (1991).
- Mengaud, J., Dramsi, S., Gouin, E., Vazquez-Boland, J. A., Milon, G., Cossart, P. Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated. Molecular Microbiology. 5, 2273-2283 (1991).
- Kocks, C., Gouin, E., Tabouret, M., Berche, P., Ohayon, H., Cossart, P. L. monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein. Cell. 68, 521-52 (1992).
- Glaser, P., et al. Comparative genomics of Listeria species. Science. 294, 849-852 (2001).
- Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape: from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
- Cossart, P. Illuminating the landscape of host-pathogen interactions with the bacterium Listeria monocytogenes. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19484-19491 (1073).
- Mengaud, J., Ohayon, H., Gounon, P., Mege, R. -. M., Cossart, P. E-cadherin is the receptor for internalin, a surface protein required for entry of L. monocytogenes into epithelial cells. Cell. 84, 923-932 (1996).
- Shen, Y., Naujokas, M., Park, M., Ireton, K. InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the Met receptor tyrosine kinase. Cell. 103, 501-510 (2000).
- Lecuit, M., Hurme, R., Pizarro-Cerda, J., Ohayon, H., Geiger, B., Cossart, P. A role for alpha-and beta-catenins in bacterial uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97, 10008-10013 (2000).
- Ireton, K., et al. A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion. Science. 274, 780-782 (1996).
- Ireton, K., Payrastre, B., Cossart, P. The Listeria monocytogenes protein InlB is an agonist of mammalian phosphoinositide 3-kinase. Journal of Biological Chemistry. 274, 17025-17032 (1999).
- Pizarro-Cerdá, J., Jonquières, R., Gouin, E., Vandekerckhove, J., Garin, J., Cossart, P. Distinct protein patterns associated with Listeria monocytogenes InlA- or InlB phagosomes. Cellular Microbiology. 4, 101-115 (2002).
- Pizarro-Cerdá, J., Payrastre, B., Wang, Y. -. J., Veiga, E., Yin, H. L., Cossart, P. Type II phosphatidylinositol 4-kinases promote Listeria monocytogenes entry into target cells. Cellular Microbiology. 9, 2381-2390 (2007).
- Hamon, M. A., et al. Histone modifications induced by a family of bacterial toxins. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 104, 17555-17559 (2007).
- Ribet, D., et al. Listeria monocytogenes impairs SUMOylation for efficient infection. Nature. 464, 1192-1195 (2010).
- Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416, 644-648 (2002).
- Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
- Cheng, L. W., Viala, J. P., Stuurman, N., Wiedemann, U., Vale, R. D., Portnoy, D. A. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, 13646-13651 (2005).
- Ripio, M. T., Domínguez-Bernal, G., Lara, M., Suárez, M., Vazquez-Boland, J. A. A Gly145Ser substitution in the transcriptional activator PrfA causes constitutive overexpression of virulence factors in Listeria monocytogenes. Journal of Bacteriology. 179, 1533-1540 (1997).
- Rajabian, T., et al. The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria. Nature Cell Biology. 11, 1212-1218 (2009).
- Gouin, E., et al. The Listeria monocytogenes InlC protein interferes with innate immune responses by targeting the IκB kinase subinit IKKα. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107, 17333-17338 (2010).
- Pizarro-Cerdá, J., Lecuit, M., Cossart, P. Measuring and analysing invasion of mammalian cells by bacterial pathogens: the Listeria monocytogenes system. Methods in Molecular Microbiology. 31, 161-177 (2002).
- Snijder, B., Sacher, R., Rämö, P., Damm, E. M., Liberali, P., Pelkmans, L. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).
