Imaging inlc Sekretion at undersøge Cellular Infektion med bakteriepatogen<em> Listeria monocytogenes</em
Summary
Listeria monocytogenes er en grampositiv bakteriel patogen, der ofte anvendes som en vigtig model til undersøgelse af intracellulære parasitter. Imaging sent L. monocytogenes infektion faser i forbindelse med små interfererende RNA skærme giver mulighed for global undersøgelse af cellulære veje er nødvendig for bakteriel infektion af target værtsceller.
Abstract
Bakterielle intracellulære patogener kan opfattes som molekylære værktøjer til at dissekere cellulære signalleringskaskader på grund af deres evne til at udsøgt manipulere og undergrave cellefunktioner, som er nødvendige for infektion af værten målvæv. Blandt disse bakterielle patogener, Listeria monocytogenes er en grampositiv mikroorganisme, der er blevet anvendt som et paradigme for intracellulær parasitisme i karakteriseringen af cellulære immunreaktioner, og som har spillet instrumentale roller i opdagelsen af molekylære mekanismer, der styrer dynamik trafficking cytoskeletale og membran. I denne artikel beskriver vi en robust mikroskopisk analyse til påvisning af sene cellulær infektion stadier af L. monocytogenes er baseret på fluorescerende mærkning af inlc, et udskilt bakterielt protein, som akkumuleres i cytoplasmaet af inficerede celler, og dette assay kan kobles til automatiserede high-throughput små interfererende RNA skærme for at forkulleacterize cellulære signalveje, der er involveret i op-eller nedregulering af infektion.
Introduction
Gram positive bakterie Listeria monocytogenes er en fødevare-patogen, der invaderer værtsceller forstyrrer dets internalisering vacuole og replikerer i cytoplasma værtsceller 1. L. monocytogenes nem manipulation i laboratoriet sammenhæng (hurtig vækst, lav toksicitet for raske individer) i forbindelse med den fortsatte bakterielle virulens træk observeret i cellulære og dyremodeller (hæmolytisk aktivitet, leukocytose) tilladt sin oprindelige brug i 1960'erne som en vigtig model for studiet af intracellulære parasitisme og til etablering af det teoretiske grundlag for cellulær immunitet mod infektion 2. I slutningen af 1980'erne og begyndelsen af 1990'erne, dissektion af den bakterielle intracellulære cyklus 3 samt molekylær karakterisering af de vigtigste bakterielle virulensfaktorer 4-7 foretrak brugen af L. monocytogenes som en vigtig molekylær værktøj til manipulation og study værts cellefunktioner. Tilstedeværelsen af avirulente (L. innocua) og virulente (L. monocytogenes) arter i Listeria slægten banede vejen for komparativ genomisk undersøgelser 8, som sammen med den nylige oprettelse af komplet V. monocytogenes transkriptom 9, har øget vores forståelse af udviklingen af L. monocytogenes som et humant patogen og som et modelsystem for infektion studerer 10.
L. monocytogenes inducerer sin internalisering i værtsceller ved interaktion af de bakterielle overfladeproteiner inla og INLB med deres værtscellereceptorer E-cadherin og mødte henholdsvis 11-12. Indledende kandidat-baserede studier førte til identifikation af α / β catenins-actin link som en væsentlig komponent i den inla-invasion vej 13 og phosphoinositid 3-kinase (PI 3-K) som en kritisk effektor af INLB- afhængig invasion cascade 14-15. Proteom og funktionelle assays efterfølgende tillod identifikation af nye cytoskeletelementer 16 og lipid second messengers 17 kræves for værtscelle invasion. Transkriptionelle undersøgelser 18 og massespektrometri-baserede kvantitative proteomics 19 har for nylig kastet nyt lys om aktivering af værten signalering kaskader og undertrykkelse af immunreaktioner i løbet af L. monocytogenes infektion. Systembiologi tilgang baseret på inaktivering af store sæt af gener (kinomes, komplette genomer) af små interfererende RNA (siRNA) lyddæmpning har for nylig åbnet nye muligheder for analyse af globale vært signalering kaskader i forbindelse med specifikke cellulære funktioner, herunder fagocytose og patogen internalisering 20. Genome-wide siRNA-skærme er tidligere blevet udført for at undersøge cellulære kaskader kræves for infektion af L. monocytogenes i fagocyterende Drosophila </em> S2-celler 21-22, men denne type analyse er ikke udført i ikke-fagocytceller, der repræsenterer kritiske mål for infektion in vivo.
Vi har optimeret en protokol for mikroskopisk påvisning af sene stadier af infektion med L. monocytogenes, der er velegnet til high-throughput siRNA studier af bakteriel indrejse inden epitelceller. Vores analyse tager fordel af en meget invasiv L. monocytogenes stamme, der præsenterer et punkt mutation i PrfA, de store transkriptionelle regulator af L. monocytogenes virulensfaktorer 6: denne mutation (opkaldt PrfA *) gør PrfA konstitutivt aktiv 23 og fører til en øget ekspression af invasionen proteinerne inla og INLB, derfor begunstige bakteriel post i ellers dårligt inficerede ikke-fagocytceller. Vores udlæsning for infektion er baseret på påvisning af den cytosoliske akkumulering af det secernerede bakterielt protein inlc: dette molekyle eren pleiotrop effektor der udtrykkes fortrinsvis ved intra-cytoplasmatisk L. monocytogenes 9, og som deltager ikke kun i den bakterielle celle-til-celle-spredning 24, men som også modulerer værtens immunresponser 25. Den fluorescerende mærkning af inlc sekretion af intracellulære bakterier ikke kun gør det muligt klart at skelne inficerede fra ikke-inficerede celler, men repræsenterer også et slutpunkt udlæsning, der kan bruges til efterfølgende at dissekere infektion i de forskellige faser: indrejse, vakuolær flugt, cytosol bakteriel spredning og celle-til-celle-spredning. Denne mikroskopi-baseret protokol kan kobles til siRNA skærme derfor at studere cellulære veje, der er involveret i infektion af værtsceller ved L. monocytogenes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flere parametre er afgørende for den succes, vores inlc-afsløring protokol, herunder brug af sunde cellelinjer viser en tilstrækkelig stor cytoplasma til at tillade en utvetydig påvisning af inlc signal. I analysen præsenterer vi i denne artikel vil vi foreslå at anvende HeLa CCL2 celler, som er særligt velegnet til vores analyse på grund af udvidelse af deres cytosol rum, andre HeLa-kloner, såsom HeLa Kyoto celler vise et mindre cytoplasma, men kan bruges med vores infektion protokol (HeLa Kyoto celler er sær…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning i P. Cossart laboratorium er støttet af Institut Pasteur, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233.348), Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE- SignRupVac), Louis-Jeantet Foundation og Fondation Le Roch Les Mousquetaires. AK er en modtager af et stipendium fra Pasteur-Paris University internationale ph.d. Program / Institut Carnot Maladies Infectieuses. Vi takker Jason Mercer for at optimere den cellulære transfektionsprotokol.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bacto Brain Heart Infusion | BD | 237500 | For liquid BHI preparation |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Supplement to liquid BHI for BHI agar plates |
| Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Biowest | 51830-500 | |
| DMEM | Invitrogen | 61965-026 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-100 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397-10ML | |
| Formaldehyde (16%) | EMS | 15710 | Prepare fresh before each experiment |
| Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A-11035 | |
| DAPI | Invitrogen | D-1306 | |
| Phalloidin Dy647 | Dyomics | 647-33 | |
| siRNA Scramble | Dharmacon | D-001810-10 | |
| siRNA Met | Dharmacon | L-003156-00-0005 | |
| Black 384-well microscopy cell culture plate | Corning | 3985 | |
| AxioObserver Z1 microscope | Zeiss | 431007 9901 | |
| sCMOS camera | Andor | Neo | |
| Metamorph analysis software | Molecular Devices | 4000 | |
| CellProfiler analysis software | Broad Institute | Public software available at http://www.cellprofiler.org/ |
References
- Pizarro-Cerdá, J., Kühbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).
- Mackaness, G. B. Cellular resistance to infection. Journal of Experimental Medicine. 116, 381-406 (1962).
- Tilney, L. G., Portnoy, D. A. Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes. Journal of Cell Biology. 109, 1597-1608 (1989).
- Mengaud, J., Chenevert, J., Geoffroy, C., Gaillard, J. L., Cossart, P. Identification of the structural gene encoding the SH-activated hemolysin of Listeria monocytogenes: listeriolysin O is homologous to streptolysin O and pneumolysin. Infection and Immunity. 55, 3225-3227 (1987).
- Gaillard, J. L., Berche, P., Frehel, C., Gouin, E., Cossart, P. Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci. Cell. 65, 1127-1141 (1991).
- Mengaud, J., Dramsi, S., Gouin, E., Vazquez-Boland, J. A., Milon, G., Cossart, P. Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated. Molecular Microbiology. 5, 2273-2283 (1991).
- Kocks, C., Gouin, E., Tabouret, M., Berche, P., Ohayon, H., Cossart, P. L. monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein. Cell. 68, 521-52 (1992).
- Glaser, P., et al. Comparative genomics of Listeria species. Science. 294, 849-852 (2001).
- Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape: from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
- Cossart, P. Illuminating the landscape of host-pathogen interactions with the bacterium Listeria monocytogenes. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19484-19491 (1073).
- Mengaud, J., Ohayon, H., Gounon, P., Mege, R. -. M., Cossart, P. E-cadherin is the receptor for internalin, a surface protein required for entry of L. monocytogenes into epithelial cells. Cell. 84, 923-932 (1996).
- Shen, Y., Naujokas, M., Park, M., Ireton, K. InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the Met receptor tyrosine kinase. Cell. 103, 501-510 (2000).
- Lecuit, M., Hurme, R., Pizarro-Cerda, J., Ohayon, H., Geiger, B., Cossart, P. A role for alpha-and beta-catenins in bacterial uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97, 10008-10013 (2000).
- Ireton, K., et al. A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion. Science. 274, 780-782 (1996).
- Ireton, K., Payrastre, B., Cossart, P. The Listeria monocytogenes protein InlB is an agonist of mammalian phosphoinositide 3-kinase. Journal of Biological Chemistry. 274, 17025-17032 (1999).
- Pizarro-Cerdá, J., Jonquières, R., Gouin, E., Vandekerckhove, J., Garin, J., Cossart, P. Distinct protein patterns associated with Listeria monocytogenes InlA- or InlB phagosomes. Cellular Microbiology. 4, 101-115 (2002).
- Pizarro-Cerdá, J., Payrastre, B., Wang, Y. -. J., Veiga, E., Yin, H. L., Cossart, P. Type II phosphatidylinositol 4-kinases promote Listeria monocytogenes entry into target cells. Cellular Microbiology. 9, 2381-2390 (2007).
- Hamon, M. A., et al. Histone modifications induced by a family of bacterial toxins. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 104, 17555-17559 (2007).
- Ribet, D., et al. Listeria monocytogenes impairs SUMOylation for efficient infection. Nature. 464, 1192-1195 (2010).
- Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416, 644-648 (2002).
- Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
- Cheng, L. W., Viala, J. P., Stuurman, N., Wiedemann, U., Vale, R. D., Portnoy, D. A. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, 13646-13651 (2005).
- Ripio, M. T., Domínguez-Bernal, G., Lara, M., Suárez, M., Vazquez-Boland, J. A. A Gly145Ser substitution in the transcriptional activator PrfA causes constitutive overexpression of virulence factors in Listeria monocytogenes. Journal of Bacteriology. 179, 1533-1540 (1997).
- Rajabian, T., et al. The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria. Nature Cell Biology. 11, 1212-1218 (2009).
- Gouin, E., et al. The Listeria monocytogenes InlC protein interferes with innate immune responses by targeting the IκB kinase subinit IKKα. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107, 17333-17338 (2010).
- Pizarro-Cerdá, J., Lecuit, M., Cossart, P. Measuring and analysing invasion of mammalian cells by bacterial pathogens: the Listeria monocytogenes system. Methods in Molecular Microbiology. 31, 161-177 (2002).
- Snijder, B., Sacher, R., Rämö, P., Damm, E. M., Liberali, P., Pelkmans, L. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).
