बैक्टीरियल पैथोजन द्वारा सेलुलर संक्रमण की जांच करने के लिए InlC स्राव इमेजिंग<em> लिस्टेरिया monocytogenes</em
Summary
लिस्टेरिया monocytogenes अक्सर intracellular सुस्ती के अध्ययन के लिए एक प्रमुख मॉडल के रूप में इस्तेमाल एक ग्राम पॉजिटिव जीवाणु रोगज़नक़ है. देर एल इमेजिंग छोटे दखल शाही सेना स्क्रीन के संदर्भ में संक्रमण चरणों monocytogenes लक्ष्य मेजबान कोशिकाओं के जीवाणु संक्रमण के लिए आवश्यक सेलुलर रास्ते की वैश्विक अध्ययन के लिए अनुमति देता है.
Abstract
बैक्टीरियल intracellular रोगज़नक़ों exquisitely हेरफेर और मेजबान लक्ष्य ऊतकों के संक्रमण के लिए आवश्यक हैं जो सेल कार्यों नाश करने के लिए अपनी क्षमता की वजह से सेलुलर संकेत Cascades काटना आणविक उपकरणों के रूप में कल्पना की जा सकती है. इन बैक्टीरिया रोगज़नक़ों के अलावा, लिस्टेरिया monocytogenes सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लक्षण वर्णन में intracellular सुस्ती के लिए एक प्रतिमान के रूप में इस्तेमाल किया गया है कि एक ग्राम सकारात्मक सूक्ष्मजीव है, और cytoskeletal और झिल्ली तस्करी गतिशीलता को नियंत्रित आणविक रास्ते की खोज में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई भूमिका निभाई है जो. इस अनुच्छेद में, हम एल की देर सेलुलर संक्रमण चरणों का पता लगाने के लिए एक मजबूत अति सूक्ष्म परख का वर्णन monocytogenes InlC, संक्रमित कोशिकाओं के cytoplasm में जम जाता है, जो एक स्रावित बैक्टीरियल प्रोटीन की फ्लोरोसेंट लेबलिंग पर आधारित है, यह परख चार के क्रम में स्वचालित उच्च throughput छोटे दखल शाही सेना स्क्रीन के लिए युग्मित किया जा सकता हैसंक्रमण के ऊपर या नीचे विनियमन में शामिल सेलुलर संकेत दे रास्ते acterize.
Introduction
ग्राम पॉजिटिव जीवाणु लिस्टेरिया monocytogenes, मेजबान कोशिकाओं पर हमला इसकी internalization रिक्तिका बाधित और मेजबान कोशिकाओं 1 के cytoplasm में replicates कि एक खाद्य जनित रोगज़नक़ है. एल सेलुलर और पशु मॉडल में मनाया बैक्टीरियल डाह लक्षण के हठ के साथ जुड़े प्रयोगशाला संदर्भ (तेजी से विकास, स्वस्थ व्यक्तियों के लिए कम विषाक्तता) में हेरफेर की आसानी monocytogenes (रक्तलायी गतिविधि, leukocytosis) के लिए एक प्रमुख मॉडल के रूप में 1960 के दशक में अपनी आरंभिक उपयोग की अनुमति दी intracellular सुस्ती की और संक्रमण 2 के खिलाफ सेलुलर प्रतिरक्षा के सैद्धांतिक नींव की स्थापना के लिए अध्ययन. देर से 1980 के दशक और 1990 के दशक में, बैक्टीरियल intracellular चक्र 3 के साथ ही सबसे महत्वपूर्ण बैक्टीरियल डाह के आणविक लक्षण वर्णन के विच्छेदन 4-7 एल के उपयोग इष्ट कारकों जोड़ – तोड़ और संवर्धन के लिए एक महत्वपूर्ण आणविक उपकरण के रूप में monocytogenesमेजबान सेल कार्यों के y. लिस्टेरिया जीनस में असंक्रामक की उपस्थिति (एल innocua) और ज़हरीले (एल monocytogenes) प्रजाति तुलनात्मक जीनोमिक अध्ययन 8 के लिए मार्ग प्रशस्त किया है कि, एक साथ पूरा एल की हाल ही में स्थापना के साथ monocytogenes एल के विकास की हमारी समझ में वृद्धि हुई है, 9 Transcriptome एक मानव रोगज़नक़ के रूप में और संक्रमण के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप monocytogenes 10 अध्ययन करता है.
एल monocytogenes अपने मेजबान सेल रिसेप्टर्स क्रमशः ई cadherin और मेट, 11-12 से बैक्टीरियल सतह प्रोटीन InlA और InlB की बातचीत पर मेजबान कोशिकाओं में इसकी internalization लाती है. प्रारंभिक उम्मीदवार आधारित अध्ययन के InlB एक महत्वपूर्ण प्रेरक के रूप में InlA-आक्रमण मार्ग 13 का और phosphoinositide 3 kinase (पीआई 3 कश्मीर) का एक महत्वपूर्ण घटक के रूप में α / β catenins actin के लिंक की पहचान करने के लिए नेतृत्व निर्भर आक्रमण cascaडी 14-15. प्रोटिओमिक और कार्यात्मक आधारित assays बाद में अनुमति दी उपन्यास cytoskeletal तत्वों 16 और मेजबान सेल आक्रमण के लिए आवश्यक लिपिड दूसरा दूत 17 की पहचान. Transcriptional पढ़ाई 18 और मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स 19 हाल ही में मेजबान cascades संकेत की सक्रियता और एल दौरान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दमन के विषय में नया प्रकाश डाला है संक्रमण monocytogenes. सिस्टम्स बायोलॉजी छोटे दखल शाही सेना द्वारा जीन (kinomes, पूरा जीनोम) के बड़े सेट की निष्क्रियता पर आधारित दृष्टिकोण (siRNA) मुंह बंद हाल ही में phagocytosis सहित विशिष्ट सेलुलर कार्यों के संदर्भ में Cascades संकेत वैश्विक मेजबान के विश्लेषण के लिए नए रास्ते खोल दिया है और रोगज़नक़ internalization 20. जीनोम चौड़ा siRNA स्क्रीन पहले से एल के संक्रमण के लिए आवश्यक सेलुलर Cascades जांच करने के लिए प्रदर्शन किया गया है phagocytic ड्रोसोफिला में monocytogenes </eएम> S2 कोशिकाओं 21-22, लेकिन विश्लेषण के इस प्रकार के गैर phagocytic कोशिकाओं में प्रदर्शन नहीं किया गया है, vivo में संक्रमण के लिए महत्वपूर्ण लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं.
हम एल द्वारा संक्रमण की देर चरणों का अति सूक्ष्म का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल अनुकूलित है उपकला कोशिकाओं के भीतर बैक्टीरियल प्रविष्टि के उच्च throughput siRNA पढ़ाई के लिए अनुकूल है कि monocytogenes. हमारे परख एक अत्यधिक आक्रामक एल का लाभ लेता है PrfA, एल के प्रमुख transcriptional नियामक में एक बिंदु उत्परिवर्तन प्रस्तुत करता है कि तनाव monocytogenes डाह 6 कारकों monocytogenes: (PrfA * नाम) इस उत्परिवर्तन 23 PrfA अनिवार्यता से सक्रिय renders और इसलिए अन्यथा खराब संक्रमित गैर phagocytic कोशिकाओं में बैक्टीरियल प्रविष्टि के पक्ष में, आक्रमण प्रोटीन InlA और InlB की एक वृद्धि की अभिव्यक्ति की ओर जाता है. संक्रमण के लिए हमारे readout secreted बैक्टीरियल प्रोटीन InlC की साइटोसोलिक संचय का पता लगाने पर आधारित है: इस अणु हैइंट्रा साइटोप्लाज्मिक एल द्वारा रियायत के तौर पर व्यक्त की है कि एक pleiotropic प्रेरक monocytogenes 9 और जो भाग लेता है बैक्टीरियल सेल करने वाली सेल में 24 फैल लेकिन यह भी मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 25 modulates जो न केवल. intracellular बैक्टीरिया द्वारा InlC स्राव के फ्लोरोसेंट लेबलिंग स्पष्ट रूप से गैर संक्रमित कोशिकाओं को संक्रमित भेद करने के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी एक अंत बिंदु बाद में इसके विभिन्न चरणों में संक्रमण काटना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि readout का प्रतिनिधित्व करता है न केवल: प्रविष्टि, vacuolar भागने, साइटोसोलिक बैक्टीरियल प्रसार और सेल करने वाली सेल प्रसार. इस माइक्रोस्कोपी आधारित प्रोटोकॉल इसलिए एल द्वारा मेजबान कोशिकाओं के संक्रमण में शामिल सेलुलर मार्ग का अध्ययन करने के लिए siRNA स्क्रीन के लिए युग्मित किया जा सकता है monocytogenes.
Protocol
Representative Results
Discussion
कई मापदंडों InlC संकेत की एक स्पष्ट पता लगाने की अनुमति एक पर्याप्त बड़ी कोशिका द्रव्य प्रदर्शित स्वस्थ कोशिका लाइनों के उपयोग सहित हमारे InlC पता लगाने प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं. परख में हम…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
पी. Cossart प्रयोगशाला में रिसर्च पाश्चर संस्थान, Institut राष्ट्रीय डे ला Sante एट डी ला Recherche médicale, Institut राष्ट्रीय डे ला Recherche Agronomique, ईआरसी उन्नत अनुदान (233348), एजेंस Nationale डे ला Recherche (अनुदान Mie द्वारा समर्थित है SignRupVac), लुइस Jeantet फाउंडेशन और Fondation ले रोच लेस Mousquetaires. एके पाश्चर पेरिस विश्वविद्यालय अंतर्राष्ट्रीय डॉक्टरल कार्यक्रम / Institut कार्नोट बुराइयों Infectieuses से एक छात्रवृत्ति के एक प्राप्तकर्ता है. हम सेलुलर अभिकर्मक प्रोटोकॉल के अनुकूलन के लिए जेसन मर्सर धन्यवाद.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bacto Brain Heart Infusion | BD | 237500 | For liquid BHI preparation |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Supplement to liquid BHI for BHI agar plates |
| Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Biowest | 51830-500 | |
| DMEM | Invitrogen | 61965-026 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-100 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397-10ML | |
| Formaldehyde (16%) | EMS | 15710 | Prepare fresh before each experiment |
| Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A-11035 | |
| DAPI | Invitrogen | D-1306 | |
| Phalloidin Dy647 | Dyomics | 647-33 | |
| siRNA Scramble | Dharmacon | D-001810-10 | |
| siRNA Met | Dharmacon | L-003156-00-0005 | |
| Black 384-well microscopy cell culture plate | Corning | 3985 | |
| AxioObserver Z1 microscope | Zeiss | 431007 9901 | |
| sCMOS camera | Andor | Neo | |
| Metamorph analysis software | Molecular Devices | 4000 | |
| CellProfiler analysis software | Broad Institute | Public software available at http://www.cellprofiler.org/ |
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