Imaging INLC Sekre att undersöka Cellular Infektion av bakteriell patogen<em> Listeria monocytogenes</em
Summary
Listeria monocytogenes är en grampositiv bakteriell patogen som ofta används som en viktig modell för studier av intracellulär parasitism. Imaging sent L. monocytogenes infektionsstadier inom ramen för små interfererande RNA-skärmar tillåter den globala undersökning av cellulära vägar som behövs för bakteriell infektion i målgruppvärdceller.
Abstract
Bakteriella intracellulära patogener kan uppfattas som molekylära verktyg för att dissekera cellulära signaleringskaskader på grund av deras förmåga att utsökt manipulera och undergräva cellfunktioner som krävs för infektion av värd målvävnader. Bland dessa bakteriella patogener, är Listeria monocytogenes en grampositiv mikroorganism, som har använts som ett paradigm för intracellulär parasitism i karakteriseringen av cellulära immunsvar, och som har spelat instrument roller i upptäckten av molekylära vägar som kontrollerar cytoskelettala och membran trafficking dynamik. I den här artikeln beskriver vi en robust mikroskopisk analys för detektion av sena cellulär infektionsstadier L. monocytogenes baseras på den fluorescerande märkningen av INLC, ett utsöndrat bakteriellt protein som ackumuleras i cytoplasman hos infekterade celler; denna analys kan kopplas till automatiserade hög genomströmning små störande RNA-skärmar för att förkolnaacterize cellulära signalvägar som är involverade i upp-eller nedreglering av infektion.
Introduction
Den grampositiva bakterien Listeria monocytogenes är en livsmedelsburen patogen som invaderar värdceller, stör dess intemalisering vakuolen och replikerar i cytoplasman i värdceller 1. L. monocytogenes enkel manipulation i laboratoriet sammanhang (snabb tillväxt, låg toxicitet för friska individer) i samband med ihållande bakteriella virulens drag som observerats i cell-och djurmodeller (hemolytisk aktivitet, leukocytos) får den tas i bruk på 1960-talet som en viktig modell för studier av intracellulär parasitism och för upprättandet av de teoretiska grunderna för cellulär immunitet mot infektion 2. I slutet av 1980 och början av 1990, dissektionen av den bakteriella intracellulära cykel 3 samt molekylär karakterisering av de viktigaste bakteriella virulensfaktorer 4-7 gynnade användningen av L. monocytogenes som en viktig molekylär verktyg för manipulering och study av värdcellfunktioner. Förekomsten av avirulenta (L. innocua) och virulenta (L. monocytogenes) arter i Listeria släktet banade väg för jämförande iska studier 8 som, tillsammans med den nyligen inrättade komplett V. monocytogenes transkriptom 9, har ökat vår förståelse av evolutionen av L. monocytogenes som en mänsklig patogen och som ett modellsystem för infektionsstudier 10.
L. monocytogenes inducerar sin interna i värdceller vid interaktion av de bakteriella ytproteiner INLA och INLB med sina värdcellreceptorer E-cadherin och Met, respektive 11-12. Initiala kandidatbaserade studier ledde till identifieringen av α / β catenins-aktin länk som en viktig komponent i INLA-invasionen vägen 13 och fosfoinositid 3-kinas (PI 3-K) som en kritisk effektor av INLB- beroende invasion cascfrån 14 till 15. Proteomik och funktionell-baserade analyser därefter tillåts identifiering av nya cytoskelettala elementen 16 och lipid andra budbärare 17 som erfordras för värdcellinvasion. Transkriptionella studier 18 och masspektrometri-baserad kvantitativa proteomik 19 har nyligen kasta nytt ljus angående aktivering av värdsignaleringskaskader och undertryckande av immunsvar under L. monocytogenes-infektion. Systembiologiska metoder baserade på inaktivering av stora uppsättningar av gener (kinomes, kompletta genom) med små störande RNA (siRNA) ljuddämpning har nyligen öppnat nya vägar för analys av globala värd signaleringskaskader i samband med specifika cellulära funktioner, inklusive fagocytos och patogen interna 20. Genomvid siRNA skärmar har tidigare utförts för att undersöka cellulära kaskader som krävs för infektion av L. monocytogenes i fagocytiska Drosophila </em> S2 celler 21-22, men denna typ av analys har inte utförts på icke-fagocyterande celler, som utgör viktiga mål för infektion in vivo.
Vi har optimerat ett protokoll för mikroskopisk upptäcka sena stadier av infektion av L. monocytogenes som är anpassade för hög genomströmning siRNA studier av bakteriell inresa inom epitelceller. Vår analys tar fördel av en mycket invasiva L. monocytogenes stam som uppvisar en punktmutation i PrfA, den huvudsakliga transkriptionsregulator av L. monocytogenes virulensfaktorer 6: denna mutation (uppkallad PrfA *) återger PrfA konstitutivt aktiv 23 och leder till ett ökat uttryck av invasionen proteiner INLA och INLB därför gynnar bakteriell inträde i annars dåligt infekterade icke-fagocytiska celler. Vår avläsning för infektion är baserad på upptäckten av den cytosoliska ackumuleringen av det utsöndrade bakteriella proteinet INLC: Denna molekyl ären pleiotropisk effekt uttrycks företrädesvis genom intra-cytoplasmatisk L. monocytogenes 9 och som deltar inte bara i det bakteriella cell-till-cell sprids 24 men som även modulerar värdimmunsvar 25. Den fluorescerande märkning av INLC utsöndring av intracellulära bakterier inte bara gör det möjligt att tydligt skilja infekterade från icke-infekterade celler, men utgör också en slutpunkt avläsning som kan användas för att senare dissekera infektion i dess olika steg: inresa, vakuolär flykt, cytosoliskt bakterie proliferation och cell-till-cell-spridning. Denna mikroskopebaserat protokoll kan kopplas till siRNA skärmar därför att studera cellulära vägar som är involverade i infektion av värdceller av L. monocytogenes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flera parametrar är avgörande för att lyckas med vår INLC-upptäckt-protokollet, inklusive användning av friska cellinjer visar en tillräckligt stor cytoplasma för att möjliggöra en entydig detektion av INLC signalen. I analysen presenterar vi i denna artikel föreslår vi användning av HeLa CCL2 celler, som är särskilt väl lämpade för vår analys på grund av förlängning av deras cytosolic utrymme, andra HeLa-kloner såsom HeLa Kyoto celler visa ett mindre cytoplasman men kan användas med vårt infekt…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning i P. Cossart laboratorium stöds av Pasteurinstitutet, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233.348), Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE- SignRupVac), Louis-Jeantet Foundation och Fondation Le Roch Les Mousquetaires. AK är en mottagare av ett stipendium från Pasteur-Paris University International Doctoral Program / Institut Carnot Maladies Infectieuses. Vi tackar Jason Mercer för att optimera cell transfektion protokollet.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bacto Brain Heart Infusion | BD | 237500 | For liquid BHI preparation |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Supplement to liquid BHI for BHI agar plates |
| Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Biowest | 51830-500 | |
| DMEM | Invitrogen | 61965-026 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-100 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397-10ML | |
| Formaldehyde (16%) | EMS | 15710 | Prepare fresh before each experiment |
| Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A-11035 | |
| DAPI | Invitrogen | D-1306 | |
| Phalloidin Dy647 | Dyomics | 647-33 | |
| siRNA Scramble | Dharmacon | D-001810-10 | |
| siRNA Met | Dharmacon | L-003156-00-0005 | |
| Black 384-well microscopy cell culture plate | Corning | 3985 | |
| AxioObserver Z1 microscope | Zeiss | 431007 9901 | |
| sCMOS camera | Andor | Neo | |
| Metamorph analysis software | Molecular Devices | 4000 | |
| CellProfiler analysis software | Broad Institute | Public software available at http://www.cellprofiler.org/ |
References
- Pizarro-Cerdá, J., Kühbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).
- Mackaness, G. B. Cellular resistance to infection. Journal of Experimental Medicine. 116, 381-406 (1962).
- Tilney, L. G., Portnoy, D. A. Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes. Journal of Cell Biology. 109, 1597-1608 (1989).
- Mengaud, J., Chenevert, J., Geoffroy, C., Gaillard, J. L., Cossart, P. Identification of the structural gene encoding the SH-activated hemolysin of Listeria monocytogenes: listeriolysin O is homologous to streptolysin O and pneumolysin. Infection and Immunity. 55, 3225-3227 (1987).
- Gaillard, J. L., Berche, P., Frehel, C., Gouin, E., Cossart, P. Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci. Cell. 65, 1127-1141 (1991).
- Mengaud, J., Dramsi, S., Gouin, E., Vazquez-Boland, J. A., Milon, G., Cossart, P. Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated. Molecular Microbiology. 5, 2273-2283 (1991).
- Kocks, C., Gouin, E., Tabouret, M., Berche, P., Ohayon, H., Cossart, P. L. monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein. Cell. 68, 521-52 (1992).
- Glaser, P., et al. Comparative genomics of Listeria species. Science. 294, 849-852 (2001).
- Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape: from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
- Cossart, P. Illuminating the landscape of host-pathogen interactions with the bacterium Listeria monocytogenes. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19484-19491 (1073).
- Mengaud, J., Ohayon, H., Gounon, P., Mege, R. -. M., Cossart, P. E-cadherin is the receptor for internalin, a surface protein required for entry of L. monocytogenes into epithelial cells. Cell. 84, 923-932 (1996).
- Shen, Y., Naujokas, M., Park, M., Ireton, K. InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the Met receptor tyrosine kinase. Cell. 103, 501-510 (2000).
- Lecuit, M., Hurme, R., Pizarro-Cerda, J., Ohayon, H., Geiger, B., Cossart, P. A role for alpha-and beta-catenins in bacterial uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97, 10008-10013 (2000).
- Ireton, K., et al. A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion. Science. 274, 780-782 (1996).
- Ireton, K., Payrastre, B., Cossart, P. The Listeria monocytogenes protein InlB is an agonist of mammalian phosphoinositide 3-kinase. Journal of Biological Chemistry. 274, 17025-17032 (1999).
- Pizarro-Cerdá, J., Jonquières, R., Gouin, E., Vandekerckhove, J., Garin, J., Cossart, P. Distinct protein patterns associated with Listeria monocytogenes InlA- or InlB phagosomes. Cellular Microbiology. 4, 101-115 (2002).
- Pizarro-Cerdá, J., Payrastre, B., Wang, Y. -. J., Veiga, E., Yin, H. L., Cossart, P. Type II phosphatidylinositol 4-kinases promote Listeria monocytogenes entry into target cells. Cellular Microbiology. 9, 2381-2390 (2007).
- Hamon, M. A., et al. Histone modifications induced by a family of bacterial toxins. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 104, 17555-17559 (2007).
- Ribet, D., et al. Listeria monocytogenes impairs SUMOylation for efficient infection. Nature. 464, 1192-1195 (2010).
- Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416, 644-648 (2002).
- Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
- Cheng, L. W., Viala, J. P., Stuurman, N., Wiedemann, U., Vale, R. D., Portnoy, D. A. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, 13646-13651 (2005).
- Ripio, M. T., Domínguez-Bernal, G., Lara, M., Suárez, M., Vazquez-Boland, J. A. A Gly145Ser substitution in the transcriptional activator PrfA causes constitutive overexpression of virulence factors in Listeria monocytogenes. Journal of Bacteriology. 179, 1533-1540 (1997).
- Rajabian, T., et al. The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria. Nature Cell Biology. 11, 1212-1218 (2009).
- Gouin, E., et al. The Listeria monocytogenes InlC protein interferes with innate immune responses by targeting the IκB kinase subinit IKKα. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107, 17333-17338 (2010).
- Pizarro-Cerdá, J., Lecuit, M., Cossart, P. Measuring and analysing invasion of mammalian cells by bacterial pathogens: the Listeria monocytogenes system. Methods in Molecular Microbiology. 31, 161-177 (2002).
- Snijder, B., Sacher, R., Rämö, P., Damm, E. M., Liberali, P., Pelkmans, L. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).
