محاكاة البنكرياس المرونة العصبية:<em> في المختبر</em> ثنائي الخلايا العصبية اللدونة الفحص
Summary
اللدونة العصبية هي ميزة المعترف بها على نحو متزايد، ولكن يفهم بشكل كاف من الجهاز الهضمي (GI) المسالك. هنا، في المثال من اضطرابات البنكرياس الإنسان، فإننا نقدم في المختبر فحص المرونة العصبية لدراسة اللدونة العصبية في الجهاز الهضمي على مستوى كل من المورفولوجية والوظيفية.
Abstract
المرونة العصبية هو سمة ملازمة للنظام والجهاز الهضمي (GI) المعوية العصبي والغدد العرقية في ظل ظروف مرضية. ومع ذلك، فإن دور المرضية في جسم المريض من المرونة العصبية في اضطرابات الجهاز الهضمي ما زال مجهولا. نماذج تجريبية الرواية التي تسمح المحاكاة والتشكيل من GI المرونة العصبية قد تمكين وتعزيز التقدير للمساهمة المرونة العصبية وبخاصة أمراض الجهاز الهضمي مثل سرطان البنكرياس (PCA) والتهاب البنكرياس المزمن (CP). هنا، نقدم بروتوكول للمحاكاة من المرونة العصبية البنكرياس في المختبر تحت ظروف استخدام الأطفال حديثي الولادة الظهري الفئران العقد الجذرية (DRG) والضفيرة العضلية المعوية (MP) الخلايا العصبية. هذا النهج المزدوج الخلايا العصبية يسمح ليس فقط رصد كل من المرونة العصبية، الجهاز الجوهرية وخارجي، ولكن أيضا تمثل أداة قيمة لتقييم ومورفولوجيا الخلايا العصبية الدبقية والكهربية. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح التشكيل وظيفية من محتويات microenvironmental الموردة لدراسة إيمباك بهمر على المرونة العصبية. بمجرد إنشائها، مقايسة المرونة العصبية الحاضر يحمل إمكانات قابلة للتطبيق على دراسة المرونة العصبية في أي جهاز GI.
Introduction
وقد اشتعلت تغييرات في الجهاز الهضمي (GI) التشكل العصبية وكثافة انتباه أخصائي أمراض الباطنة والأطباء لفترة طويلة، ولكن أهميتها لالفيزيولوجيا المرضية لأمراض الجهاز الهضمي ما زال مجهولا 1-3. في الواقع، وترتبط العديد من الاضطرابات الشائعة GI عاليا مثل التهاب المعدة، التهاب المريء الجزر، والتهاب القولون، انسدادات، والتهاب الزائدة الدودية مع زيادة كثافة تعصيب في مناطق الأنسجة الملتهبة 1. ومع ذلك، فقد تم حتى الآن دفع أي اهتمام حقيقي لآليات ومعنى المرونة العصبية في الجهاز الهضمي. لا الأعصاب GI تغير شكليا تختلف من الأعصاب GI العادي، أي دولة طبيعية في الجهاز العصبي المعوي، من حيث وظيفتها؟ ما هي الآثار المترتبة على تغير المحتوى نيوروبيبتيدي / الناقل العصبي في الأعصاب المعوية البلاستيك؟ لا المرونة العصبية الطرفية تنطوي دائما يشير إلى تغير في الجهاز العصبي المركزي؟ وأين هي التوقعات المركزية للextri البلاستيكNSIC مسارات GI العصبية؟ ويمكن بسهولة أن تتولد سلسلة طويلة من هذه الأسئلة الأساسية عند النظر إلى قلة معرفتنا عن الجوانب الفنية للGI المرونة العصبية.
دراسة GI المرونة العصبية على مستوى وظيفي يتطلب نماذج تجريبية صالحة، واستنساخه تزال تنطبق بسهولة. في عصر تزايد شعبية وقبول النماذج المعدلة وراثيا المشروطة الماوس (GECoMM)، مثل الإعدادات في الجسم الحي تحمل القدرة على توضيح جوانب لم تكن معروفة سابقا من GI المرونة العصبية بطريقة واقعية 1. ومع ذلك، فإن تصميم وإنتاج GECoMM تبقى مكلفة، وكثيفة العمالة، وخاصة، تستغرق وقتا طويلا. وعلاوة على ذلك، فإنها تتطلب بداهة اختيار الهدف المراد التضمين مشروط في الماوس المعدلة وراثيا (المعدلة وراثيا مثل overexpression من عامل نمو الأعصاب / نيسان الخليج في الخلايا الظهارية المعوية). وبالتالي، لقصرIGN من GECoMM ناجحة، يحتاج الباحثون بعض المؤشرات (مثل البيانات التجريبية السابقة) من هدف جدير بالاهتمام، أي أن جزيء من الفائدة (هنا NGF) يمكن على الأقل أن يتوقع أن تمارس بعض الآثار ذات الصلة بيولوجيا الأعصاب في معهد جوته.
ويمكن بسهولة أن تستمد هذه المؤشرات كافية من نماذج في المختبر الذي فرعية خلية معزولة عن المكروية معقدة لفي الجسم الحي النظام يمكن cocultured انتقائي بطريقة غيروي 4-7. التشكيل الأهداف الجزيئية في مثل هذا الإعداد الثقافة غيروي هو في المتوسط من الناحية الفنية أقل تعقيدا، وأسرع، وبالتالي يمكن أن تساعد في prefiltering أهداف جديرة بالاهتمام للتحقق في في الدراسات المجراة.
في الآونة الأخيرة، قدمنا في المختبر فحص المرونة العصبية التي صممت لمحاكاة زيادة كثافة العصبية وتضخم في شمال شرق داخل البنكرياسrves في سرطان البنكرياس الإنسان (PCA) والتهاب البنكرياس المزمن (CP) الأنسجة. هنا، تعرضت الخلايا العصبية المشتقة من الأطفال حديثي الولادة الظهري الفئران الجذر العقد (DRG) أو الضفيرة العضلية المعوية (MP) لمقتطفات من الأنسجة PCA مقطوعة جراحيا أو CP أنسجة العينات ومقارنة تلك المستزرعة في البنكرياس الإنسان العادي (NP) مقتطفات الأنسجة 5. بدلا من مقتطفات الأنسجة، ويمكن للمرء أيضا استخدام خط الخلية supernatants لدراسة تأثير أنواع الخلايا المحددة على المرونة العصبية. عند دمجها مع قياس كيمونسيجيا موحدة، المرونة العصبية مقايسة قدمت يسمح تقييم صالحة وقابلة للتكرار من اللدونة العصبية في البنكرياس استجابة لmicroenvironments مختلفة. خاصة، فإنه يسمح للمحاكاة 1) المرونة العصبية المورفولوجية، أي تغييرات في ثمرة neurite، المتفرعة نمط وحجم الخلايا العصبية، و2) المرونة العصبية الوظيفية، أي تغييرات في استثارة الخلايا العصبية الطرفية. علاوة على ذلك، ليس فقط الطرفية (أي </em> المعوية)، ولكن أيضا المركزية (على سبيل المثال DRG أو الثانية الشوكي النظام) يمكن تضمين الخلايا العصبية في مقايسة الحاضر لتقييم رد فعل المورفولوجية والوظيفية لمختلف محتويات الأنسجة GI. في فيديو تعليمي الحاضر، ونحن لشرح بروتوكول التقنية لأداء هذا الاختبار ومناقشة مزايا ونقاط ضعفها. وعلاوة على ذلك، نود أن نلفت الانتباه إلى انطباق المفهوم الأساسي لهذا الفحص لدراسة المرونة العصبية في أي جهاز GI.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويهدف هذا البروتوكول لتوضيح المنهجية وراء البنكرياس في المختبر فحص المرونة العصبية التي تم تطويرها مؤخرا من قبل مجموعتنا لدراسة آليات المرونة العصبية في محكمة التحكيم الدائمة وCP 5. يتضمن البروتوكول إجراء لمدة ثلاثة أيام والتي يمكن بسهولة أن تطبق مرة واحد…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ساهمت جميع المؤلفين نحو إنشاء والتحقق من صحة مقايسة المطروحة ومشروع للمخطوطة.
Materials
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1149 | |
| Ornithine/laminin | Sigma-Aldrich | P2533/L4544 | |
| 13mm coverslips | Merck | For use in 24-well plates | |
| Dismembranator S | Sartorius | ||
| Anti-Beta-III-tubulin antibody | Millipore | MAB1637 | 1:200 concentration |
| Anti-GFAP-antibody | DAKO | M0761 | 1:400 concentration |
| RIPA buffer + protease inhibitor | Any supplier | ||
| Neurobasal medium | Gibco/Life sciences | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Gibco/Life sciences | 17504044 | Quality of B-27 is known to depend on the lot number |
| Gentamicin/Metronidazol | Any supplier | ||
| Minimal essential medium | Gibco/Life sciences | 31095-029 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life sciences | 24020133 | Improves collagenase activity when containing Ca/Mg |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | CLS-2 | Obtain lots with at least 200U/mg activity |
| Trypsin-EDTA 0,25% | Gibco/Life sciences | 25200056 | |
| 4% Paraformaldehyde | Any supplier | ||
| analySIS docu software | Olympus |
References
- Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity. Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).
- Vasina, V., et al. Enteric neuroplasticity evoked by inflammation. Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).
- Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation. Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).
- Demir, I. E., et al. . Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).
- Demir, I. E., et al. The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity. Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).
- Schafer, K. H., Mestres, P. The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally. Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).
- Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system. Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).
- Liebl, F., et al. The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer. Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).
- Schäfer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract. Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).
- Ceyhan, G. O., et al. Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).
- Demir, I. E., et al. Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).
- Joseph, N. M., et al. Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut. J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).
