Simuleren Pancreatic Neuroplasticity:<em> In Vitro</em> Dual-neuron Plasticiteit Assay
Summary
Neuronale plasticiteit is een steeds meer erkend, maar onvoldoende duidelijk kenmerk van de gastro-intestinale (GI) stelsel. Hier, in het voorbeeld van menselijke pancreas aandoeningen presenteren we een in vitro assay neuroplasticiteit voor de studie van neuronale plasticiteit in het maagdarmkanaal, zowel morfologisch en functioneel niveau.
Abstract
Neuroplasticiteit is een inherent kenmerk van het enterische zenuwstelsel en gastro-intestinale (GI) innervatie onder pathologische omstandigheden. Echter, de pathofysiologische rol van neuroplasticiteit in GI-aandoeningen blijft onbekend. Nieuwe experimentele modellen die simulatie en modulatie van GI neuroplasticiteit toe kunnen verbeterde waardering voor de bijdrage van neuroplasticiteit in het bijzonder GI ziekten zoals pancreaskanker (PCA) en chronische pancreatitis (CP) in te schakelen. Hier presenteren we een protocol voor de simulatie van de pancreas neuroplasticiteit onder in vitro omstandigheden met behulp van pasgeboren ratten ganglia (DRG) en myenterische plexus (MP) neuronen. Deze dual-neuron aanpak het mogelijk om niet alleen de monitoring van zowel orgel-intrinsieke en extrinsieke-neuroplasticiteit, maar vertegenwoordigt ook een waardevol instrument om neuronale en gliale morfologie en elektrofysiologie beoordelen. Bovendien maakt de functionele modulatie van de meegeleverde micro-omgeving van de inhoud voor het bestuderen van hun IMPACt op neuroplasticiteit. Eenmaal vastgesteld, de onderhavige neuroplasticiteit test draagt de potentieel van toepassing op de studie van neuroplasticiteit in elk GI orgaan.
Introduction
Veranderingen in gastro-intestinale (GI) zenuw morfologie en dichtheid hebben de aandacht van gastro-enterologen en pathologen gevangen voor een lange tijd, maar het belang daarvan voor de pathofysiologie van GI-aandoeningen blijft onbekend 1-3. Sterker nog, een aantal zeer gemeenschappelijke GI aandoeningen zoals gastritis, refluxoesofagitis, colitis, diverticulitis en appendicitis worden geassocieerd met een verhoogde innervatie dichtheid in ontstoken weefsel gebieden 1. Er is echter geen echte aandacht tot nu toe besteed aan de mechanismen en de betekenis van neuroplasticiteit in het maag-darmkanaal. Heeft morfologisch veranderde GI zenuwen afwijken van de normale GI zenuwen, dat wil zeggen de normale toestand van het enterische zenuwstelsel, in termen van hun functie? Wat zijn de gevolgen van veranderde neuropeptide / neurotransmitter inhoud in plastic enterische zenuwen? Ofwel perifere neuroplasticiteit brengen altijd veranderde signalering naar het centrale zenuwstelsel? En waar zijn de centrale projecties van plastic extriNSIC GI zenuwbanen? Een lange reeks van dergelijke belangrijke vragen kunnen eenvoudig worden gegenereerd als we kijken naar het gebrek aan kennis over de functionele aspecten van GI neuroplasticiteit.
De studie van GI neuroplasticiteit op functioneel niveau vereist geldige, reproduceerbare en nog steeds gemakkelijk toepasbaar experimentele modellen. In een tijdperk van toenemende populariteit en acceptatie van genetisch gemanipuleerde conditionele muismodellen (GECoMM), zoals in vivo instellingen dragen het potentieel om voorheen onbekende facetten van GI neuroplasticiteit te ontrafelen in een realistische manier 1. Echter, het ontwerp en de productie van GECoMM blijft duur, arbeidsintensief en vooral tijdrovend. Bovendien, ze vereisen het a priori selectie van de doelstelling om voorwaardelijk worden gemoduleerd in de genetisch veranderde muis (zoals transgene overexpressie van zenuwgroeifactor / NGF in enterische epitheelcellen). Vandaar dat voor de desIGN van een succesvolle GECoMM, onderzoekers moeten sommige indicatoren (bv. vorige experimentele gegevens) van een waardevol doel, dat wil zeggen dat het molecuul van belang (hier NGF) ten minste kan worden verwacht om een aantal biologisch relevante effecten op de GI zenuwen uitoefenen.
Dergelijke indicatoren kunnen eenvoudig worden afgeleid uit geschikte in vitro modellen waarin geïsoleerde cel subtypes van het complex micromilieu van een in vivo systeem selectief kan worden gekweekt samen op heterotypische wijze 4-7. De modulatie van eiwitten in dergelijke heterotypische cultuur instelling gemiddeld minder technisch omslachtig, sneller, en derhalve helpen bij het voorfilteren van nuttige doelen voor verificatie in vivo studies.
Onlangs presenteerden we een in vitro neuroplasticiteit assay die werd ontworpen om te simuleren het verhoogde neurale dichtheid en hypertrofie van intrapancreatic nerves in menselijke alvleesklierkanker (PCA) en chronische pancreatitis (CP) weefsels. Hier neuronen afgeleid van pasgeboren rat dorsale wortel ganglia (DRG) of myenterische plexus (MP) werden blootgesteld aan weefselextracten van chirurgisch weggesneden PNA CP weefsels specimens en vergeleken met die gekweekt in normale humane pancreas (NP) weefselextracten 5. In plaats van weefsel extracten, kan men ook gebruik maken van cellijn bovenstaande vloeistoffen om de impact van geselecteerde celtypen op neuroplasticiteit te bestuderen. In combinatie met een gestandaardiseerde morfometrische meting de gepresenteerde neuroplasticiteit test kan bruikbaar en reproduceerbare beoordeling van neuronale plasticiteit in reactie op verschillende micro-omgevingen alvleesklier. In het bijzonder, kan de simulatie van 1) morfologische neuroplasticiteit, dus de veranderingen in de neuriet uitgroei, vertakking en neuronale maat, en 2) functionele neuroplasticiteit, dus veranderingen in de prikkelbaarheid van perifere neuronen. Bovendien zijn niet alleen randapparaat (dwz </em> Enterische), maar ook centraal (bijv. DRG en tweede orde spinale) neuronen kunnen in de onderhavige bepalingsmethode hun morfologische en functionele reactie op verschillende inhoud GI weefsel te beoordelen. In de huidige video tutorial laten we zien het technisch protocol voor het uitvoeren van deze test en bespreken de voordelen en zwakke punten. In het bijzonder vestigen wij de aandacht op de toepasselijkheid van de fundamentele notie van deze test aan de studie van neuroplasticiteit in een GI orgel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het huidige protocol is bedoeld om de methode te illustreren achter de in vitro alvleesklier neuroplasticiteit test die onlangs werd ontwikkeld door onze groep om de mechanismen van neuroplasticiteit te bestuderen in PCa en CP 5. Het protocol omvat een driedaagse procedure die gemakkelijk kan worden aangebracht nadat de uitvoerder voldoende ervaring in de isolatie en de cultuur van DRG en MP neuronen heeft opgedaan. Bovendien vormt het een waardevol instrument voor het bestuderen van de gelijktijdige…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alle auteurs bijgedragen aan de totstandkoming en validatie van de gepresenteerde analyse en het ontwerp van het manuscript.
Materials
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1149 | |
| Ornithine/laminin | Sigma-Aldrich | P2533/L4544 | |
| 13mm coverslips | Merck | For use in 24-well plates | |
| Dismembranator S | Sartorius | ||
| Anti-Beta-III-tubulin antibody | Millipore | MAB1637 | 1:200 concentration |
| Anti-GFAP-antibody | DAKO | M0761 | 1:400 concentration |
| RIPA buffer + protease inhibitor | Any supplier | ||
| Neurobasal medium | Gibco/Life sciences | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Gibco/Life sciences | 17504044 | Quality of B-27 is known to depend on the lot number |
| Gentamicin/Metronidazol | Any supplier | ||
| Minimal essential medium | Gibco/Life sciences | 31095-029 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life sciences | 24020133 | Improves collagenase activity when containing Ca/Mg |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | CLS-2 | Obtain lots with at least 200U/mg activity |
| Trypsin-EDTA 0,25% | Gibco/Life sciences | 25200056 | |
| 4% Paraformaldehyde | Any supplier | ||
| analySIS docu software | Olympus |
References
- Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity. Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).
- Vasina, V., et al. Enteric neuroplasticity evoked by inflammation. Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).
- Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation. Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).
- Demir, I. E., et al. . Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).
- Demir, I. E., et al. The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity. Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).
- Schafer, K. H., Mestres, P. The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally. Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).
- Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system. Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).
- Liebl, F., et al. The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer. Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).
- Schäfer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract. Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).
- Ceyhan, G. O., et al. Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).
- Demir, I. E., et al. Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).
- Joseph, N. M., et al. Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut. J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).
