Simula Pancreatic Neuroplasticity:<em> In Vitro</em> Dual-neuron Plasticity analys
Summary
Neuronal plasticitet är en alltmer erkänd, men otillräckligt förstådd inslag i gastrointestinala (GI) tarmkanalen. Här, i det exempel av humana pankreatiska störningar, presenterar vi en in vitro neuroplasticityen analys för studier av neuronal plasticitet i mag-tarmkanalen på både morfologisk och funktionell nivå.
Abstract
Neuroplasticity är en inneboende egenskap hos det enteriska nervsystemet och gastrointestinala (GI) innervation i patologiska tillstånd. Dock kvarstår det patofysiologisk roll neuroplasticityen i GI störningar okänd. Nya experimentella modeller som möjliggör simulering och modulering av GI neuroplasticity kan möjliggöra ökad uppskattning av bidraget från neuroplasticityen särskilt GI sjukdomar som cancer i bukspottkörteln (PCA) och kronisk pankreatit (CP). Här presenterar vi ett protokoll för simulering av bukspottskörteln neuroplasticityen under in vitro-betingelser som använder nyfödd råtta dorsalrotsganglier (DRG) och myentericus plexus (MP) nervceller. Denna dubbla neuron strategi inte bara tillåter övervakning av både orgel-inneboende och-yttre neuroplasticity, utan också utgör ett värdefullt verktyg för att bedöma neuronala och gliaceller morfologi och elektrofysiologi. Dessutom tillåter den funktionell modulering av medföljande microenvironmental innehåll för att studera deras IMPACt på neuroplasticity. När etablerade, bär det nuvarande neuroplasticity analysen potential att vara tillämplig på studiet av neuroplasticitet i någon GI-organ.
Introduction
Förändringar i gastrointestinal (GI) nerv morfologi och densitet har uppmärksammats av gastroenterologer och patologer under lång tid, men deras betydelse för patofysiologin av GI sjukdomar är okänd 1-3. I själva verket är flera mycket vanliga GI sjukdomar såsom gastrit, refluxesofagit, kolit, divertikulit, och blindtarmsinflammation i samband med ökad innervation tätheten i inflammerade vävnadsområden 1. Dock har ingen verklig uppmärksamhet hittills ägnats mekanismerna och betydelsen av neuroplasticityen i mag-tarmkanalen. Äger morfologiskt förändrade GI nerver skiljer sig från normala gastrointestinala nerver, dvs det normala tillståndet för det enteriska nervsystemet, i termer av deras funktion? Vilka är konsekvenserna av förändrad neuropeptid / signalsubstans innehåll i plastenter nerver? Anser perifer neuroplasticityen alltid innebär förändrad signalering till det centrala nervsystemet? Och var är de centrala projektioner av plast extriNSIC GI nervbanor? En lång rad av sådana nyckelfrågor kan lätt genereras när man tittar på bristen på kunskap om funktionella aspekter av GI neuroplasticitet.
Studien av GI neuroplasticityen på funktionell nivå kräver giltiga, reproducerbara och ändå lätt tillämpliga experimentella modeller. I en tid av ökande popularitet och acceptans av genetiskt modifierade modeller villkor mus (GECoMM), som in vivo-inställningar bära potential att belysa tidigare okända aspekter av GI neuroplasticity på ett realistiskt sätt 1. Dock fortfarande kostsam konstruktion och produktion av GECoMM, arbetsintensiv och, framför allt, tidskrävande. Dessutom kräver de att a priori urval av målet som ska villkormoduleras i genetiskt förändrade musen (t.ex. transgena uttryck av nervtillväxtfaktorn / NGF i tarm epitelceller). Därför för den design av en framgångsrik GECoMM, forskare behöver vissa indikatorer (t.ex. tidigare experimentella data) i ett givande mål, det vill säga att åtminstone kan förväntas molekylen av intresse (här NGF) för att utöva några biologiskt relevanta effekter på GI nerver.
Sådana indikatorer kan lätt härledas från adekvat in vitro-modeller, där isolerade cell subtyper från komplexet mikromiljön av ett in vivo-system kan selektivt samodlades i en hetero sätt 4-7. Moduleringen av molekylära mål på ett sådant hetero kultur inställning är i genomsnitt tekniskt mindre betungande, snabbare, och kan därför hjälpa till vid förfiltrering av värdefulla mål för verifiering i de vivo-studier.
Nyligen presenterade vi en in vitro neuroplasticity analys som var utformad för att simulera ökad neural densitet och hypertrofi av intrapancreatic nerves i human cancer i bukspottkörteln (PCA) och kronisk pankreatit (CP) vävnader. Här var neuroner härledda från nyfödd råtta dorsala rotganglier (DRG) eller plexus myentericus (MP) som utsätts för vävnadsextrakt från kirurgiskt resekerade PCa eller CP vävnader exemplar och jämfördes med de odlades i normal human pankreas (NP) vävnadsextrakt 5. I stället för vävnadsextrakt, kan man även använda cellinje supernatanter att undersöka effekterna av utvalda celltyper på neuroplasticity. När den kombineras med ett standardiserat morfometrisk mätning tillåter presenteras neuroplasticityen analysen giltig och reproducerbar bedömning av neuronal plasticitet som svar på olika pankreatiska mikromiljöer. Särskilt tillåter simulering av 1) morfologisk neuroplasticity, det vill säga förändringar i neuritutväxt, förgrening mönster och neuronal storlek, och 2) funktionell neuroplasticity, det vill säga förändringar i retbarhet av perifera nervceller. Dessutom, inte bara perifera (dvs. </em> Enter), men också centralt (t.ex. DRG eller andra ordningen spinal) nervceller kan inkluderas i föreliggande analys för att bedöma deras morfologiska och funktionella reaktion på olika GI vävnadsinnehåll. I föreliggande video tutorial, visar vi den tekniska protokoll för utförandet av denna analys och diskutera sina fördelar och svagheter. Dessutom drar vi uppmärksamheten på tillämpligheten av den grundläggande föreställningen om denna analys till studiet av neuroplasticitet i någon GI-organ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det nuvarande protokollet är avsett att illustrera metodiken bakom bukspottskörteln neuroplasticity-analysen in vitro som nyligen utvecklats av vår grupp för att studera mekanismerna bakom neuroplasticitet i PCA och CP 5. Protokollet innebär en tredagars förfarande som lätt kan appliceras en gång utövande har fått tillräcklig erfarenhet av isolering och odling av DRG och MP nervceller. Dessutom utgör den ett värdefullt verktyg för att studera samtidig reaktion av enter och DRG-associera…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alla författare har bidragit till inrättandet och validering av den presenterade analysen och utkastet av manuskriptet.
Materials
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1149 | |
| Ornithine/laminin | Sigma-Aldrich | P2533/L4544 | |
| 13mm coverslips | Merck | For use in 24-well plates | |
| Dismembranator S | Sartorius | ||
| Anti-Beta-III-tubulin antibody | Millipore | MAB1637 | 1:200 concentration |
| Anti-GFAP-antibody | DAKO | M0761 | 1:400 concentration |
| RIPA buffer + protease inhibitor | Any supplier | ||
| Neurobasal medium | Gibco/Life sciences | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Gibco/Life sciences | 17504044 | Quality of B-27 is known to depend on the lot number |
| Gentamicin/Metronidazol | Any supplier | ||
| Minimal essential medium | Gibco/Life sciences | 31095-029 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life sciences | 24020133 | Improves collagenase activity when containing Ca/Mg |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | CLS-2 | Obtain lots with at least 200U/mg activity |
| Trypsin-EDTA 0,25% | Gibco/Life sciences | 25200056 | |
| 4% Paraformaldehyde | Any supplier | ||
| analySIS docu software | Olympus |
References
- Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity. Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).
- Vasina, V., et al. Enteric neuroplasticity evoked by inflammation. Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).
- Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation. Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).
- Demir, I. E., et al. . Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).
- Demir, I. E., et al. The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity. Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).
- Schafer, K. H., Mestres, P. The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally. Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).
- Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system. Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).
- Liebl, F., et al. The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer. Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).
- Schäfer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract. Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).
- Ceyhan, G. O., et al. Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).
- Demir, I. E., et al. Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).
- Joseph, N. M., et al. Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut. J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).
