यह प्रक्रिया आईआर प्रतिदीप्ति चूहों में कोलेजन remodeling गतिविधियों की इमेजिंग के साथ ही विकृत कोलेजन किस्में के साथ संकरण के लिए तस्वीर चालू किया जा सकता है कि बंदी कोलेजन अनुकरण करनेवाला पेप्टाइड का उपयोग ऊतक वर्गों में कोलेजन की पूर्व vivo धुंधला निकट vivo में दर्शाता है.
कोलेजन ऊतक गठन और रखरखाव का समर्थन करता है कि बाह्य मैट्रिक्स का एक प्रमुख संरचनात्मक घटक है. कोलेजन remodeling के सामान्य ऊतकों नवीकरण का एक अभिन्न हिस्सा है हालांकि, remodeling गतिविधि का अत्यधिक मात्रा में ट्यूमर, गठिया, और कई अन्य रोग की स्थिति में शामिल है. कोलेजन remodeling के दौरान, कोलेजन अणुओं की ट्रिपल पेचदार संरचना बाह्य वातावरण में proteases से बाधित है. इसके अलावा, कई ऊतकीय ऊतकों के नमूनों में मौजूद कोलेजन आंशिक रूप से निर्धारण और संरक्षण प्रक्रियाओं द्वारा विकृत कर रहे हैं. इसलिए, इन विकृत कोलेजन किस्में जैविक इमेजिंग के लिए के रूप में प्रभावी लक्ष्यों की सेवा कर सकते हैं. हम पहले से फोटो ट्रिगर कोलेजन के लिए अद्वितीय है जो ट्रिपल पेचदार संरचना, गठन से विकृत कोलेजन किस्में के साथ संकरण के लिए हो सकता है कि एक बंदी कोलेजन अनुकरण करनेवाला पेप्टाइड (सीएमपी) विकसित की है. इस प्रक्रिया के समग्र लक्ष्यों विकृत कोलेजन किस्में r छवि के लिए) मैं कर रहे हैंvivo में सामान्य remodeling गतिविधियों से esulting, और द्वितीय) फोटो ट्रिगर कैद CMPs का उपयोग पूर्व vivo ऊतक वर्गों में कोलेजन कल्पना करने के लिए. प्रभावी संकरण और vivo और पूर्व vivo इमेजिंग में सफल प्राप्त करने, fluorescently लेबल कैद CMPs फोटो सक्रिय या तो नसों में इंजेक्शन से ठीक पहले कर रहे हैं, या सीधे ऊतक वर्गों पर सक्रिय कर रहे हैं. उपसर्ग माउस कॉर्निया ऊतक वर्गों में नग्न चूहों और कोलेजन में सामान्य कंकाल कोलेजन remolding इस प्रक्रिया में imaged हैं. यहाँ प्रस्तुत सीएमपी-कोलेजन संकरण तकनीक पर आधारित इमेजिंग विधि ऊतक remodeling प्रक्रिया की गहरी समझ को बढ़ावा, साथ ही उच्च कोलेजन remodeling गतिविधि के साथ जुड़े रोगों के लिए नए निदान के विकास की अनुमति दे सकता.
कोलेजन, स्तनपायी में सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन, प्रसार और कोशिकाओं की भिन्नता का समर्थन करके ऊतकों के विकास और उत्थान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. रेशेदार कोलेजन (जैसे प्रकार मैं, द्वितीय), संयोजी ऊतक में ऊतकों को यांत्रिक शक्ति देते हैं, नेटवर्क की तरह कोलेजन (प्रकार चतुर्थ) कोशिकाओं देते हैं और संगठित ऊतकों फार्म जहां तहखाने झिल्ली की बुनियादी पाड़ के रूप में. कोलेजन remodeling कोलेजन गिरावट (proteases से) और संश्लेषण (वृद्धि कारकों द्वारा पदोन्नत) दोनों शामिल है. कोलेजन remodeling, हड्डी में उदाहरण के लिए, सामान्य ऊतक नवीकरण प्रक्रिया, अतिरिक्त remodeling गतिविधि, या असामान्य स्थानों में घटना का हिस्सा है हालांकि, आम तौर पर इंगित करता है घाव एक चोट या इस तरह के कैंसर, ऑस्टियोपोरोसिस, गठिया जैसे जीर्ण रोग की स्थिति के जवाब चिकित्सा, और फाइब्रोसिस 1-4. सीधे छवि कोलेजन vivo में remodeling के दौर से गुजर करने की क्षमता प्रगति की समझ सकती हैइन रोगों के आयन, साथ ही नए निदान और चिकित्सा. उदाहरण के लिए, लाइव इमेजिंग गंभीरता और रोगों के स्थान के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं, और भी नए चिकित्सीय एजेंट की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Multiphoton लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी और दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी रहते चूहों 5 में ट्यूमर में बाह्य मैट्रिक्स remodeling की निगरानी के लिए छवि तंतुमय कोलेजन को लागू किया गया है. हालांकि, इस तकनीक को एक आक्रामक प्रक्रिया है, जो पारदर्शी पृष्ठीय skinfold कक्षों के साथ रखा जा करने जानवरों की आवश्यकता है. कोलेजन remodeling के प्रत्यक्ष और noninvasive इमेजिंग विशेष रूप से remodeling के दौर से गुजर कोलेजन कि लक्ष्य एक जांच से लाभ होगा. इस तरह की जांच यह सामान्य ऊतकों 6 में प्रचुर मात्रा में हैं, जो बरकरार है और परिपक्व कोलेजन, से remodeling कोलेजन भेद करने की जरूरत है के बाद से तैयार करने के लिए मुश्किल है.
कोलेजन है जो ट्रिपल हेलिक्स बुलाया अत्यंत दुर्लभ प्रोटीन संरचना, से बना हैऐसे कोलेजन remodeling के दौरान मैट्रिक्स metalloproteinases (एमएमपी) के रूप में proteases से cleaved. cleaved कोलेजन टुकड़े उनके ट्रिपल पेचदार संरचना खो देते हैं और आगे अविशिष्ट proteases 1 से पच जाता है जो सामने आया किस्में (जिलेटिन), हो जाते हैं. यह हाल ही में ट्रिपल पेचदार संरचना में गुना करने के लिए प्रवृत्ति है जो कोलेजन अनुकरण करनेवाला पेप्टाइड (सीएमपी) विशेष रूप से या तो गर्मी विकृतीकरण द्वारा या एंजाइमी गिरावट 1,7 द्वारा अपनी ट्रिपल पेचदार राज्य से अलग कर रहे हैं, जो कोलेजन किस्में लक्षित कर सकते हैं कि खोज की थी. बंधन मुख्यतः मोनोमेरिक CMPs और विकृत कोलेजन किस्में के बीच ट्रिपल हेलिक्स संकरण द्वारा संचालित है. CMPs कोलेजन संकरण, एक बंदी सीएमपी के लिए थोड़ा प्रेरणा शक्ति के साथ कमरे के तापमान पर homotrimeric ट्रिपल हेलिक्स में स्वयं को इकट्ठा क्योंकि [(जीपीओ) 4 नायब जीपीओ (जीपीओ) 4, नायब (जीपीओ) 9 के रूप में नामित, हे: हाइड्रॉक्सीप्रोलाइन], विकसित किया गया था , जो एक तस्वीर cleavable nitrobenzyl शामिलसमूह (नो बॉल) पेप्टाइड की केंद्रीय ग्लाइसिन से जुड़ी. नायब पिंजरे समूह sterically ट्रिपल हेलिक्स में तह से सीएमपी रोकता है, अभी तक, यूवी विकिरण से पिंजरे समूह को हटाने के तुरंत ट्रिपल पेचदार तह और कोलेजन संकरण 1 से चलाता है. निकट अवरक्त (NIR) fluorophores के साथ लेबल मोनोमेरिक CMPs प्रणालीबद्ध चूहों को मॉडल के लिए दिया जाता है, वे विशेष रूप से लक्ष्य और सामान्य (जैसे हड्डी और उपास्थि में) के दौर से गुजर ऊतकों और रोग (जैसे ट्यूमर में) 1 remodeling में विकृत कोलेजन के vivo इमेजिंग में अनुमति दे सकते हैं .
Fluorescently लेबल CMPs भी ऊतकीय ऊतक वर्गों में कोलेजन इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ऊतकीय अध्ययन में, काटा ऊतकों अक्सर सेलुलर घटकों और गिरावट से समग्र ऊतक आकारिकी रखने के निर्धारण द्वारा संरक्षित कर रहे हैं. गर्मी, और कार्बनिक विलायकों के साथ उपचार, और रासायनिक पार लिंकिन में शामिल हैं जो फिक्सिंग प्रक्रियाओं,जी अभिकर्मकों (जैसे paraformaldehyde), कोलेजन 8 की ट्रिपल पेचदार संरचना denature. इस विकृतीकरण सीएमपी संकरण के लिए साइटों को उत्पन्न करता है. ऐसा लगता है कि fluorescently लेबल CMPs विशेष रूप से और भी अधिक प्रभावी ढंग से तांतव जिगर के ऊतकों 9 में वैकृत शर्तों के सतही पहचान अनुमति दी है जो एक विरोधी कोलेजन एंटीबॉडी, की तुलना में निश्चित ऊतक वर्गों में कोलेजन (जैसे त्वचा, कॉर्निया, और हड्डी) बाध्य कर सकते हैं दिखाया गया है. सीएमपी कोलेजन के सभी प्रकार के लिए आम है जो ट्रिपल पेचदार रूपांकनों के अमीनो एसिड अनुक्रम युक्त विकृत कोलेजन किस्में लक्ष्य. इसलिए सीएमपी एक व्यापक स्पेक्ट्रम कोलेजन धुंधला एजेंट माना जा सकता है. यहाँ, हम fluorescently लेबल कैद CMPs का उपयोग vivo में विकृत कोलेजन किस्में और पूर्व vivo ऊतक वर्गों में द्वितीय) visualizing कोलेजन इमेजिंग) मैं के लिए विस्तृत प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं प्रस्तुत करते हैं. एक Nir टैग, IR680, लाइव इमेजिंग, whil के लिए बंदी सीएमपी संयुग्मित गया थाई carboxyfluorescein (सीएफ) मानक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के साथ अपनी संगतता के लिए ऊतक धुंधला काम में इस्तेमाल किया गया था. इस प्रोटोकॉल कोलेजन remodeling के लिए संबंधित के रूप में CMPs की इमेजिंग आवेदन पर केंद्रित है. सीएमपी संश्लेषण के लिए तरीके पिछली रिपोर्टों 1,7,9-15 में पाया जा सकता है. इस वीडियो रिपोर्ट में, सामान्य चूहों और माउस कॉर्निया के ऊतक वर्गों में इमेजिंग कंकाल ऊतकों प्रदर्शन उद्देश्य के लिए चुना गया है, यहाँ प्रस्तुत तरीकों आसानी के रूप में, कोलेजन remodeling (जैसे ट्यूमर, घाव भरने) से जुड़े कई विकृतियों और जैविक मॉडलों के लिए लागू किया जा सकता है लेकिन अच्छी तरह से कोलेजन होता है कि लगभग किसी भी उपसर्ग ऊतक नमूने के रूप में.
इस प्रोटोकॉल में देखा जा सकता है बंदी CMPs की यूवी सक्रियण आम पूंछ नस इंजेक्शन प्रोटोकॉल 19 को ही अतिरिक्त कदम है के बाद से, सीएमपी का वितरण सीधा है. कुंजी एक Uncaged और metastable एकल कतरा राज्य में पेप्टाइड जांच इंजेक्षन है. पिंजरे समूह स्वयं विधानसभा से सीएमपी रोकता है और यह सीएमपी ट्रिपल हेलिक्स में गुना करने के लिए शुरू होता है, जो बिंदु पर पराबैंगनी प्रकाश से निकाल दिया जाता है जब तक कोलेजन (चित्रा 2 बी) के लिए बाइंडिंग. इंजेक्शन तैयार करने के लिए जल्दी विषाक्तता को कम करने के लिए पराबैंगनी विकिरण के दौरान cleaved पिंजरे समूह के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं जो सिस्टीन, शामिल हैं. विभिन्न प्रकारों (जैसे SKH -1 और डॉ.-1) के साथ कई चूहों इस निर्माण का उपयोग कर परीक्षण किया गया है, और हम छह महीने तक इन चूहों में किसी भी व्यवहार या अन्य स्वास्थ्य दोषों का पता नहीं चला. इंजेक्शन यूवी जोखिम के तुरंत बाद का पालन नहीं करता है, CMPs कोई संकरण की क्षमता है, जो homotrimeric ट्रिपल हेलिक्स में गुना होगा. चित्रा -2 इंजेक्शन के लिए पहले CMPs पूरी तरह से लंबे समय से देरी समय (> 2 दिन) द्वारा ट्रिपल हेलिक्स में पुन: संयोजित किया गया है, जहां एक चरम मामले से पता चलता है. इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, सीएमपी समाधान अपेक्षाकृत कम एकाग्रता (जैसे ~ 40 माइक्रोन) में तैयार किया, और तुरंत यूवी decaging के बाद चूहों में इंजेक्शन की जानी चाहिए. क्योंकि कमजोर स्थिति में CMPs की धीमी गति ट्रिपल हेलिक्स तह दर (refolding का आधा समय:> 50 मिनट) का और कम जोखिम यूवी और इंजेक्शन समय (5 ~ 7 मिनट कुल), CMPs के अधिकांश में एकल खून में प्रवेश इस प्रोटोकॉल का पालन किया जाता है जब प्रपत्र किनारा. एकाग्रता reassembling दर 18 में नाटकीय कमी के लिए अग्रणी रक्त पूल में 20 का एक पहलू से कम हो जाता है के रूप में एक बार इंजेक्शन, CMPs, एकल किस्में के रूप में रहने की उम्मीद कर रहे हैं. इंजेक्शन देरी हो रही है (जैसे की वजह से जानवर से निपटने के लिए) और homotrimeric refolding संदिग्ध है, आंशिक रूप से इकट्ठे पेप्टाइड्स 70 से ऊपर के लिए हीटिंग द्वारा सक्रिय किया जा सकता है76, सी शीघ्र ठंडा और इंजेक्शन द्वारा पीछा एकल किस्में, को CMPs अलग कर देना. कम सुविधाजनक हालांकि, ऐसी गर्मी अलग CMPs भी चित्रा (2 डी) को निशाना बनाने में विवो के नतीजे उम्मीद दिखा.
NIR संकेत के ऊपर से 50% बाल द्वारा अवरुद्ध किया जा सकता है क्योंकि इस प्रदर्शन में, नग्न चूहों NIR प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया. बालों माउस मॉडल (काला बाल के साथ विशेष रूप से लोगों) के साथ काम करते हैं, हम एक इलेक्ट्रिक शेवर या बाल हटानेवाला का उपयोग इमेजिंग के लिए पहले ब्याज के क्षेत्र में माउस हजामत बनाने की सलाह देते हैं. चित्रा 1 में, पशु आहार में chlorophylls के ऑटो प्रतिदीप्ति के कारण होता है जो जानवर के पेट क्षेत्र से झूठी सकारात्मक संकेत भी हैं. इस तरह की पृष्ठभूमि संकेत काफी लगभग 4 दिन पहले इमेजिंग शुद्ध करने के लिए भोजन करने के लिए माउस स्विचन द्वारा कम किया जा सकता है. आंकड़े 1 और 2 में देखा, मजबूत सीएमपी uptakes चक्कर में कर रहे हैंई. इसलिए, अपूर्ण पूंछ नस इंजेक्शन से उत्पन्न कलाकृतियों से बचने के लिए, हम इंजेक्शन साइट प्रतिदीप्ति छवि में कब्जा नहीं है कि इतनी पूंछ के पीछे भाग में इंजेक्शन लगाने की सलाह देते हैं.
लेबल सीएमपी अन्य तरीकों का उपयोग कर पता लगाने के लिए मुश्किल हो जाता है कि इन विवो में कोलेजन remodeling के विशिष्ट स्थानों को निशाना और इमेजिंग में सक्षम बनाता है. उदाहरण के लिए, एलिसा आधारित रक्त और मूत्र assays cleaved कोलेजन telopeptide टुकड़े के लिए संवेदनशील हैं, लेकिन यह घुलनशील एंटीजन को लक्षित करता है क्योंकि विधि, कोलेजन कारोबार का स्रोत स्थानीय बनाना नहीं कर सकते हैं. NIR का उपयोग vivo इमेजिंग तकनीक के मुख्य सीमाओं हीमोग्लोबिन 680/710 एनएम NIR रंगों की एक अंतर्जात पीने की वस्तु के रूप में CMPs समीपस्थ जमा लाल कोशिकाओं द्वारा गहराई से पैठ क्षीणन और शमन हैं लेबल. Vivo इमेजिंग में सीएमपी का भविष्य अनुप्रयोगों प्रत्यक्ष गामा उत्सर्जन radionuclides के साथ या पोजीट्रान ईएमआई के साथ लेबल CMPs का उपयोग SPECT या पीईटी इमेजिंग शामिलtters, कोलेजन remodeling (जैसे ऑस्टियोपोरोसिस, गठिया, atherosclerosis, और फाइब्रोसिस) से जुड़े रोग राज्यों के निदान के लिए. ये रेडियो लेबल सीएमपी analogs ऊतक गहराई और जमा लाल कोशिकाओं की उपस्थिति की वजह से संकेत नुकसान की सीमाओं को समाप्त होगा, और रोगग्रस्त ऊतकों की मात्रात्मक माप की अनुमति देगा. इसके अलावा, अपेक्षाकृत देर इमेजिंग समय (जैसे 48-96 HPI) CMPs की धीमी बाध्यकारी और मंजूरी से उत्पन्न यह मुश्किल कोलेजन remodeling में तेजी से परिवर्तन का पालन करने के लिए कर सकता है. ये सीमा बंधन कैनेटीक्स और सीएमपी इमेजिंग एजेंट की आत्मीयता के आगे इंजीनियरिंग द्वारा दूर किया जा सकता है. सीएमपी छोटी संरचना है जो विकृत कोलेजन को बांध के बाद से, सीएमपी आधारित कोलेजन इमेजिंग जो कर सकते हैं केवल छवि कोलेजन फाइबर 5 दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी माइक्रोस्कोपी के पूरक है.
Fluorescently लेबल CMPs साथ ऊतक वर्गों धुंधला हो जाना, हम इसे लाभप्रद सेते पाया4 डिग्री सेल्सियस, पर यूवी सक्रिय पेप्टाइड समाधान में नमूने ट्रिपल पेचदार संकरण कम तापमान 1,20 में मदद की है क्योंकि. यह भी एक धुंधला जार में ताजा पीबीएस बफर में स्लाइड्स डुबो केवल नमूने के ऊपर धोने बफ़र्स pipetting से बेहतर काम करता है, जो अपार CMPs बंद धोने के लिए सबसे प्रभावी तरीका है कि पाया गया था. सीएमपी-कोलेजन किनारा संकरण बहुत विशिष्ट और मजबूत है, इसलिए इस वीडियो में प्रस्तुत सरल धुंधला प्रोटोकॉल तत्काल अतिरिक्त बायोमार्कर costaining के लिए संशोधित, और unfixed ऊतक वर्गों में अपमानित कोलेजन की पहचान करने के लिए किया जा सकता है. यह विभिन्न ऊतकीय नमूनों में रेशेदार कोलेजन का पता लगाने के लिए विरोधी कोलेजन एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए एक प्रभावी और सुविधाजनक विकल्प है.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों तकनीकी सहायता के लिए गिल्बर्ट ग्रीन धन्यवाद. इस काम एमजीपी को सम्मानित किया NIAMS / एनआईएच (R01-AR060484) और DOD (W81XWH-12-1-0555) SMY को सम्मानित किया, से और एनआईएच (U24 CA92871 और U54 CA151838) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया
IRdye 680RD Maleimide (IR680) | LI-COR | 929-71050 | Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere1 |
5(6)-Carboxyfluorescein | Sigma | 21877-5G-F | Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere12 |
Cysteine | Advanced Chemtech | YC2200 | |
Isoflurane | Butler Veterinary Supply | 4/4/5260 | |
Goat Serum | Sigma | G9023-10ML | |
Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma | A9647 | |
DAPI | Roche Applied Science | 10236276001 | |
Fluoroshield mounting medium | Sigma | F6182-20ML | |
Equipment | |||
Syringes | BD | 329461 | |
UV lamp | McMaster-Carr | 1447T17 | |
Pearl impulse imager | LI-COR | 9400 | |
Surgical forceps and scissors | |||
EasyDip slide staining system | Light Labs | M900-12B | |
20-place cardboard microscope slide tray | Light Labs | ||
Cover glasses | Fisher | 12-545-c | |
Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE2000-E |