Questa procedura dimostra in vivo vicino IR imaging di fluorescenza delle attività di rimodellamento del collagene nei topi, nonché ex vivo colorazione di collagene in sezioni di tessuto con gabbia collagene peptidi mimetici che possono essere foto-attivati per ibridare con fili di collagene denaturato.
Il collagene è un importante componente strutturale della matrice extracellulare che supporta la formazione di tessuto e manutenzione. Sebbene rimodellamento del collagene è parte integrante di rinnovo normale tessuto, eccessiva quantità di attività rimodellamento è coinvolto nei tumori, artrite e molte altre condizioni patologiche. Durante rimodellamento del collagene, la struttura a tripla elica di molecole di collagene è interrotto da proteasi nell'ambiente extracellulare. Inoltre, collageni presenti in molti campioni istologici sono parzialmente denaturate dai processi di fissazione e conservazione. Pertanto, questi filamenti di collagene denaturate possono servire come obiettivi efficaci per l'imaging biologico. Abbiamo già sviluppato un peptide di collagene mimetica in gabbia (CMP), che può essere foto-triggered per ibridare con fili di collagene denaturate formando la struttura a tripla elica, che è unica al collagene. Gli obiettivi generali di questa procedura sono i) per l'immagine filamenti di collagene denaturato resulting dalle normali attività di rimodellamento in vivo, e ii) per visualizzare collagene in ex sezioni di tessuto vivo utilizzando i CMP Caged foto-attivato. Per raggiungere ibridazione efficace e di successo in vivo ed ex vivo di imaging, CMP in gabbia fluorescente sono o-photo attivato immediatamente prima dell'iniezione endovenosa, o sono azionati direttamente su sezioni di tessuto. Normale scheletrico rimodellamento del collagene in topi nudi e collagene nelle sezioni prefissati topo di tessuto corneale sono ripreso in questa procedura. Il metodo di imaging basata sulla tecnologia ibridazione CMP-collagene qui presentato potrebbe portare ad una maggiore comprensione del processo di rimodellamento tissutale, nonché consentire lo sviluppo di nuovi strumenti diagnostici per le malattie associate all'attività elevato rimodellamento del collagene.
Il collagene, la proteina più abbondante nel mammifero, gioca un ruolo fondamentale nello sviluppo dei tessuti e la rigenerazione sostenendo proliferazione e differenziazione delle cellule. Mentre collageni fibrosi (ad esempio di tipo I, II), nei tessuti connettivi dare resistenza meccanica ai tessuti, il collagene reticolare (tipo IV) formano impalcatura di base della membrana basale in cui le cellule si attaccano e formano tessuti organizzati. Rimodellamento del collagene coinvolge sia degradazione del collagene (da proteasi) e sintesi (promosso da fattori di crescita). Sebbene rimodellamento del collagene, per esempio in osso, fa parte del normale processo di rinnovamento dei tessuti, l'attività rimodellamento eccesso, o la sua presenza in posizioni anomale, indica tipicamente cicatrizzanti risposta ad un trauma o patologie croniche come il cancro, l'osteoporosi, l'artrite, e fibrosi 1-4. La capacità di collageni immagine direttamente in fase di rimodellamento in vivo potrebbe portare alla comprensione dei progressiione di queste malattie, così come nuovi strumenti diagnostici e terapie. Ad esempio, l'imaging dal vivo in grado di fornire informazioni sulla gravità e la posizione delle malattie, e può anche essere utilizzato per valutare l'efficacia di nuovi agenti terapeutici. Multiphoton microscopia a scansione laser e generazione di seconda armonica sono state applicate a collageni fibrillari immagine per monitorare rimodellamento della matrice extracellulare in tumore in topi vivi 5. Tuttavia, questa tecnica richiede animali da montare con le camere plica dorsale trasparenti, che è una procedura invasiva. Rappresentazione diretta e non invasiva di rimodellamento del collagene beneficerà di una sonda che si rivolge specificamente collagene in fase di ristrutturazione. Tale sonda è difficile preparare quanto deve distinguere i collageni rimodellamento dai collageni normali e mature, che sono abbondanti nei tessuti normali 6.
Il collagene è costituito da proteine struttura estremamente rara chiamata tripla elica, che èspaccati da proteasi come metalloproteinasi della matrice (MMP) durante rimodellamento del collagene. I frammenti di collagene spaccati perdono la loro struttura a tripla elica e diventano fili piegati (gelatina), ulteriormente digeriti da proteasi aspecifici 1. E 'stato recentemente scoperto che il peptide mimetico collagene (CMP), che ha la propensione a piegare in struttura a tripla elica può rivolgono specificamente filamenti di collagene che si dissociano dal suo stato tripla elica da una denaturazione calore o da degradazione enzimatica 1,7. L'associazione è guidata principalmente da tripla elica ibridazione tra CMP monomeriche e le ciocche di collagene denaturato. Perché CMP auto-assemblano in triple eliche omotrimerica a temperatura ambiente con poca forza trainante per il collagene ibridazione, un CMP in gabbia [(GPO) 4 NB GPO (GPO) 4, designato come NB (GPO) 9, O: idrossiprolina], è stato sviluppato , che contiene un nitrobenzil foto distaccabilegruppo (NB) attaccato alla glicina centrale del peptide. Il gruppo gabbia NB impedisce stericamente il CMP di piegatura in tripla elica, ancora, la rimozione del gruppo gabbia per irraggiamento UV innesca subito la piegatura tripla elica del collagene e ibridazione 1. Quando CMP monomeriche etichettati con vicino infrarosso (NIR) fluorofori sono sistematicamente consegnati a modello i topi, possono rivolgono specificamente e permettere imaging in vivo di collagene denaturate nei tessuti sottoposti a normale (per esempio in osso e la cartilagine) e patologici (ad esempio nei tumori) rimodellamento 1 .
CMP fluorescente possono essere utilizzati anche per l'imaging collageni in sezioni di tessuto istologici. In studio istologico, i tessuti raccolti sono spesso conservati da fissazione per mantenere i componenti cellulari e la morfologia dei tessuti in generale dal deterioramento. Le procedure di fissaggio, che comprendono calore, e il trattamento con solventi organici e chimici cross-linking reagenti (ad esempio paraformaldeide), snaturare la struttura a tripla elica del collagene 8. Questo denaturazione genera i siti per CMP ibridazione. E 'stato dimostrato che i CMP fluorescente possono legarsi specificamente a collageni in sezioni di tessuto fissate (ad esempio pelle, cornea, e osso) ancora più efficace di un anticorpo anti-collagene, che ha permesso l'identificazione facile di condizioni patologiche in tessuti del fegato fibrotici 9. Il CMP rivolge fili di collagene denaturato contenenti sequenza amminoacidica di motivi tripla elica, che è comune a tutti i tipi di collagene. Pertanto CMP può essere considerato un ampio spettro agente collagene colorazione. Qui vi presentiamo procedure sperimentali dettagliate per i) l'imaging fili di collagene denaturato in vivo e collagene ii) visualizzando in ex sezioni di tessuto vivo con CMP Caged fluorescente. Un tag NIR, IR680, è stato coniugato al CMP gabbia per l'imaging dal vivo, while carboxyfluorescein (CF) è stato utilizzato nel tessuto lavoro colorazione per la sua compatibilità con microscopi a fluorescenza standard. Questo protocollo si concentra sulla applicazione di imaging del CMP, ritenuti correlati al rimodellamento del collagene. Metodi per la sintesi CMP possono essere trovati nelle precedenti relazioni 1,7,9-15. In questo rapporto video, immagini tessuti scheletrici in topi normali e sezioni tissutali di topo cornea sono stati scelti per scopo dimostrativo, ma i metodi qui presentati possono essere facilmente applicati a molte patologie e modelli biologici che coinvolgono rimodellamento del collagene (ad esempio i tumori, la guarigione delle ferite), come nonché a quasi ogni campione di tessuto prefissata contenente collagene.
Come si può vedere in questo protocollo, la consegna di CMP è semplice poiché la UV-attivazione dei CMP gabbia è l'unico passaggio aggiuntivo alla coda comune protocolli di iniezione vena 19. La chiave è quello di iniettare le sonde peptide in uno stato a singolo filamento Uncaged e metastabile. Il gruppo gabbia impedisce CMP di auto-assemblaggio e vincolante di collagene (Figura 2b) fino a quando non viene rimosso dalla luce UV a questo punto il CMP inizia a piegare in tripla elica. La formulazione iniettabile contiene cisteina, che può reagire rapidamente con il gruppo gabbia spaccati durante l'irradiazione UV per minimizzare la tossicità. Numerosi topi con ceppi diversi (ad esempio SKH-1 e DR-1) sono stati testati utilizzando questa formulazione, e non abbiamo rilevare eventuali difetti di salute comportamentali o di altri in questi topi fino a sei mesi. Se l'iniezione non segue immediatamente dopo l'esposizione ai raggi UV, i CMP si piega in triple eliche omotrimerica, che non hanno capacità di ibridazione. Figura 2C mostra un caso estremo in cui prima dell'iniezione i CMP sono stati completamente riassemblati in triple eliche da tempo di ritardo lungo (> 2 giorni). Per aggirare questo problema, la soluzione CMP deve essere preparato in concentrazione relativamente bassa (ad es ~ 40 micron), e iniettato in topi subito dopo UV-decaging. A causa della ridotta velocità tripla elica piegatura delle CMP in condizioni diluite (primo tempo di ripiegamento:> 50 min) e la breve esposizione UV e il tempo di iniezione (5 ~ 7 min totale), la maggior parte dei CMP entrano nel flusso ematico in single- strand forma quando questo protocollo è seguita. Una volta iniettato, CMP dovrebbero rimanere come singoli trefoli, come la concentrazione viene ridotta di un fattore 20 nel pool sanguigna, con conseguente drastica riduzione del tasso rimontaggio 18. Se l'iniezione è in ritardo (ad esempio per la movimentazione degli animali) e ripiegamento omotrimerica si sospetta, i peptidi parzialmente assemblati possono essere riattivati dal riscaldamento sopra 7076; C dissociare i CMP di filamenti singoli, seguiti da rapido raffreddamento e di iniezione. Anche se meno conveniente, tali CMP-calore dissociata anche mostrare risultati attesi in vivo di targeting (Figura 2D).
In questa dimostrazione, topi nudi sono stati usati per NIR fluorescenza perché fino al 50% del segnale NIR può essere bloccato da capelli. Quando si lavora con modelli murini pelo (soprattutto quelli con i capelli neri), si consiglia la rasatura il mouse nella regione di interesse prima di imaging con un rasoio elettrico o di rimozione dei capelli. In figura 1, vi sono segnali falsi positivi regione addominale dell'animale, che è causata da auto-fluorescenza delle clorofille nella dieta animale. Tali segnali di fondo possono essere significativamente ridotte passando il mouse per diete purificate circa 4 giorni prima di imaging. Come visto nelle figure 1 e 2A, vi sono forti assorbimenti CMP nello spin codae. Pertanto, per evitare artefatti derivanti da iniezioni coda vena imperfetti, si consiglia di iniettare nella parte posteriore della coda in modo che il sito di iniezione non viene catturata l'immagine in fluorescenza.
Il CMP etichettato consente di targeting e di imaging di luoghi specifici di rimodellamento del collagene in vivo che sono difficili da rilevare con altri metodi. Per esempio, i saggi di sangue ed urine basati ELISA sono sensibili per frammenti collagene telopeptide spaccati, ma il metodo non possono localizzare la fonte del turnover del collagene, perché riguarda antigeni solubili. Le principali limitazioni della tecnica di imaging in vivo utilizzando NIR etichettati CMP sono attenuazione della profondità di penetrazione e tempra da prossimali pooled globuli rossi come emoglobina è un quencher endogena di 680/710 nm coloranti NIR. Le future applicazioni di CMP di imaging in vivo comprendono SPECT o PET di imaging utilizzando CMP marcati con radionuclidi gamma emittenti diretti o con positroni emitters, per la diagnosi di patologie che coinvolgono il rimodellamento del collagene (ad esempio, l'osteoporosi, l'artrite, l'aterosclerosi, e fibrosi). Questi CMP analoghi radio-marcati eliminerà le limitazioni della perdita di segnale dovuta alla profondità dei tessuti e la presenza di globuli rossi pool, e consentiranno misurazioni quantitative dei tessuti malati. Inoltre, il tempo di imaging relativamente tardi (ad esempio 48-96 HPI) derivanti dalla lenta liquidazione vincolante e di CMP potrebbe rendere difficile seguire rapidi cambiamenti nel rimodellamento del collagene. Tale limitazione può essere superata con una ulteriore ingegnerizzazione delle cinetiche di legame e l'affinità di agenti di imaging CMP. Poiché CMP si lega al collagene denaturate che hanno poca struttura, imaging a base di collagene-CMP è complementare alla seconda microscopia generazione di armoniche che può solo fibre di collagene immagine 5.
Quando la colorazione di sezioni di tessuto con contrassegnati in modo fluorescente CMP, abbiamo trovato vantaggioso per incubare l'campioni nelle soluzioni peptide-UV attivato a 4 ° C, perché l'ibridazione a tripla elica è facilitata a temperatura inferiore a 1,20. Si è anche scoperto che immergendo i vetrini in PBS fresco in un barattolo di colorazione è il modo più efficace per lavare i CMP non associati, che funziona molto meglio che limitarsi a pipettaggio tamponi di lavaggio sui campioni. L'ibridazione CMP-collagene filamento è molto preciso e robusto, per cui il semplice protocollo di colorazione presentata in questo video può essere facilmente modificato per costaining biomarcatori supplementari, e per identificare collagene degradati in sezioni di tessuto non fissati. Questo è un efficace e conveniente alternativa all'utilizzo di anticorpi anti-collagene per rilevare collageni fibrosi in vari campioni istologici.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano Gilbert verde per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal NIAMS / NIH (R01-AR060484) e DOD (W81XWH-12-1-0555) assegnato a SMY, e dal NIH (U24 CA92871 e U54 CA151838) attribuiti a MGP
IRdye 680RD Maleimide (IR680) | LI-COR | 929-71050 | Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere1 |
5(6)-Carboxyfluorescein | Sigma | 21877-5G-F | Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere12 |
Cysteine | Advanced Chemtech | YC2200 | |
Isoflurane | Butler Veterinary Supply | 4/4/5260 | |
Goat Serum | Sigma | G9023-10ML | |
Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma | A9647 | |
DAPI | Roche Applied Science | 10236276001 | |
Fluoroshield mounting medium | Sigma | F6182-20ML | |
Equipment | |||
Syringes | BD | 329461 | |
UV lamp | McMaster-Carr | 1447T17 | |
Pearl impulse imager | LI-COR | 9400 | |
Surgical forceps and scissors | |||
EasyDip slide staining system | Light Labs | M900-12B | |
20-place cardboard microscope slide tray | Light Labs | ||
Cover glasses | Fisher | 12-545-c | |
Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE2000-E |