Upptäckt av nya intracellulära patogener från Amoebal Coculture och Amoebal anrikning Approaches
Summary
Amoebal samodling är ett cellodlingssystem med användning av vidhäftande amöbor att selektivt växa intracellulära patogener kunna motstå fagocytiska celler såsom amöbor och makrofager. Den utgör därmed ett viktigt verktyg för att upptäcka nya smittämnen. Amoebal anrikning möjliggör upptäckten av nya amoebal arter och deras specifika intracellulära bakterier.
Abstract
Intracellulära patogener såsom legionella, mykobakterier och Chlamydia liknande organismer är svåra att isolera, eftersom de ofta växer dåligt eller inte alls på selektiva media som vanligtvis används för att odla bakterier. Av detta skäl är många av dessa patogener har endast nyligen upptäckts eller följande viktiga utbrott. Dessa patogener är ofta förknippade med amöbor, som fungerar som värdcell och tillåta överlevnad och tillväxt av bakterierna. Vi har för avsikt här att tillhandahålla en demonstration av två tekniker som tillåter isolering och karakterisering av intracellulära patogener närvarande i kliniska eller miljöprover: det amoebal samodling och amoebal anrikning. Amoebal samodling möjliggör återvinning av intracellulära bakterier genom att ympa det undersökta provet på en amoebal gräsmatta som kan smittas och lyseras av intracellulära bakterier som finns i provet. Amoebal anrikning möjliggör återvinning av amöbor närvarande i en klinisk eller miljöprov. Thär kan leda till upptäckten av nya amoebal arter men också av nya intracellulära bakterier som växer särskilt i dessa amöbor. Tillsammans utgör dessa två tekniker hjälpa att upptäcka nya intracellulära bakterier som kan växa i amöbor. På grund av deras förmåga att infektera amöbor och motstå fagocytos kan dessa intracellulära bakterier också undkomma fagocytos genom makrofager och därmed vara patogena för högre eukaryoter.
Introduction
Före tillkomsten av molekylär diagnostik, var mikroorganismer som finns i miljö nischer eller i kliniska prover ofta upptäcks genom att odla dem på olika selektiva medier, främst på agar i petriskålar. Fenotypen av de bakteriella kolonierna och deras metaboliska aktivitet tilläts sedan bakteriell klassificering vid artnivå. Buljongen kan också användas för att öka känsligheten för detektering. Däremot behöver båda teknikerna inte tillåta återvinning av bakterier som växer långsamt eller inte alls på dessa medier. Detta är anledningen till att molekylära metoder så ofta används nuförtiden. Ändå upptäckt av DNA ger ingen aning om lönsamheten för bakterierna. Dessutom, i motsats till kultur, molekylära metoder inte leder till en stam som kan kännetecknas vidare.
Studera patogener som växer dåligt på fasta medier eller som behöver cellerna att växa är komplicerat. De flesta av dessa "svårt att växa" bakterier är sparsmakad intracellulära bakterier, ofta upptäcks och kännetecknas efter stora utbrott som det var fallet för Legionella pneumophila. Denna bakterie karakteriserades efter ett utbrott som inträffade under en American Legion konvent. Så många som 182 personer smittades och 29 dog på grund av en svår lunginflammation 1,2. Det senare visade att amöbor var de naturliga värdar för denna bakterie och att deras närvaro i hotellluftkonditioneringssystemet och vattennäten var ursprunget till utbrottet av den så kallade legionärssjuka 3.
Amoebae är närvarande över hela världen och isolerades från jord, luft, vatten och nässlemhinnan av frivilliga försökspersoner (översikt i 4). Dessa "free-living" amöbor i allmänhet dela autonomt i miljön men kan ibland invadera tillåt värdar 5. Amöbor feed på olika mikroorganismer genom fagocytos och efterföljande lysosomala matsmältningen genom hydrolases 6. Många fakultativa eller förpliktigar intracellulära bakterier kan motstå nedbrytning och därmed infektera och dela i amöbor som t.ex. Legionella, Chlamydia-relaterade bakterier eller mykobakterier (över i 7 och 8). Free-levande amöbor sannolikt utgör en viktig potentiell reservoar för intracellulära bakterier som ännu inte har upptäckts. Detta ledde vår grupp att genomföra i Lausanne två huvudsakliga tekniker som kallas amoebal coculture och amoebal anrikning, vilket gjorde olika grupper för att isolera flera nya obligata intracellulära mikroorganismer från olika miljöprover 9-15.
Eftersom amöbor är professionella fagocyter betar på bakterier, kan en bakterie som kan motstå fagocytos och växa inuti dessa protister också kolonisera mänskliga fagocyter och vara patogena mot människor. Detta var delvis visats för vissa Chlamydia-relaterade bakterier, liksom Waddlia chondrophila. W. chondrophila kan växa inte bara i amöbor, men också i ett flertal celltyper såsom däggdjurs epitelceller, makrofager, och fiskcellinjer 16-18. Den amoebal coculture visas också relevant för att detektera intracellulära bakterier i kliniska prover 19,20, inklusive avföring som är starkt förorenade med olika bakteriearter 21.
Här beskriver vi de viktigaste stegen i amoebal coculture och amoebal anrikning, inklusive (a) behandling av miljö-eller kliniska prover, (b) tillväxt av amöbor på axeniska medier och på en bakteriell gräsmatta av Escherichia coli och (c) val och karakterisering av intracellulära bakterier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Amoebal coculture och amoebal anrikning är effektiva metoder som tillät isoleringen av många nya bakterie-och amoebal arter. Resultat som erhållits med dessa metoder bekräftar den allestädes närvarande både amöbor och amöbabeständiga bakterier i miljön, och mest intressant i konstgjorda vattennätverk som anses styras av kemiska behandlingar såsom klorering och ozonering. Amoebal coculture och amoebal anrikning är viktiga verktyg för att isolera och odla dessa potentiellt patogena mikroorganismer och att …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Pr. Bernard La Scola för hjälp tekniska råd och intressant diskussion om amoebal coculture och amoebal anrikning. Vi tackar också Dr Vincent Thomas för hans hjälp i genomförandet av tekniken i vårt laboratorium.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 108342 | |
| 0.22 μm pore size membrane | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCVPU11RE | |
| proteose peptone | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 211693 | |
| yeast extract | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 212750 | |
| Cell culture flasks | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 353135 | |
| Kova slide | Hycor, Indianapolis, IN | 87144 | |
| cell culture microplates | Corning Inc, Corning, NY | 3524 | |
| Diff-Quik staining kit | Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany | 130832 | |
| Ziehl fuchsin | Fluka, St-Louis, MI | 21820 | |
| basic fuchsin | Sigma, St-Louis, MI | 857843 | |
| Phenol | Sigma, St-Louis, MI | P1037 | Corrosive and mutagenic |
| malachite green oxalate | Fluka, St-Louis, MI | 63160 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15710 | |
| Saponin | Sigma, St-Louis, MI | 84510 |
References
- Fraser, D. W., et al. Legionnaires’ disease: description of an epidemic of pneumonia. New Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).
- McDade, J. E., et al. Legionnaires’ disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease. New Engl. J. Med. 297, 1197-1203 (1977).
- Rowbotham, T. J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae. J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).
- Rodriguez-Zaragoza, S. Ecology of free-living amoebae. Crit. Rev. Microbiol. 20, 225-241 (1994).
- Booton, G. C., Visvesvara, G. S., Byers, T. J., Kelly, D. J., Fuerst, P. A. Identification and distribution of Acanthamoeba species genotypes associated with nonkeratitis infections. J Clin. Microbiol. 43, 1689-1693 (2005).
- Brussow, H. Bacteria between protists and phages: from antipredation strategies to the evolution of pathogenicity. Molecular microbiology. 65, 583-589 (2007).
- Greub, G., Raoult, D. Microorganisms resistant to free-living amoebae. Clin. Microbiol. Rev. 17, 413-433 (2004).
- Thomas, V., McDonnell, G., Denyer, S. P., Maillard, J. Y. Free-living amoebae and their intracellular pathogenic microorganisms: risks for water quality. FEMS Microbiol Rev. 34, 231-259 (2010).
- Birtles, R. J., Rowbotham, T. J., Storey, C., Marrie, T. J., Raoult, D. Chlamydia-like obligate parasite of free-living amoebae. Lancet. 349, 925-926 (1997).
- Amann, R., et al. Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia spp. Appl. Environ. Microbiol. 63, 115-121 (1997).
- Birtles, R. J., et al. Candidatus Odyssella thessalonicensis’ gen. nov., sp. nov., an obligate intracellular parasite of Acanthamoeba species. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 63-72 (2000).
- Thomas, V., Casson, N., Greub, G. Criblamydia sequanensis, a new intracellular Chlamydiales isolated from Seine river water using amoebal co-culture. Environ. Microbiol. 8, 2125-2135 (2006).
- Pagnier, I., Raoult, D., La Scola, B. Isolation and identification of amoeba-resisting bacteria from water in human environment by using an Acanthamoeba polyphaga co-culture procedure. Environ. Microbiol. 10, 1135-1144 (2008).
- Thomas, V., Loret, J. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environ. Microbiol. 10, 2728-2745 (2008).
- Corsaro, D., et al. Novel Chlamydiales strains isolated from a water treatment plant. Environ. Microbiol. 11, 188-200 (2009).
- Goy, G., Croxatto, A., Greub, G. Waddlia chondrophila enters and multiplies within human macrophages. Microbes Infect. 10, 556-562 (2008).
- Kebbi-Beghdadi, C., Cisse, O., Greub, G. Permissivity of Vero cells, human pneumocytes and human endometrial cells to Waddlia chondrophila. Microbes Infect. 13, 566-574 (2011).
- Kebbi-Beghdadi, C., Batista, C., Greub, G. Permissivity of fish cell lines to three Chlamydia-related bacteria: Waddlia chondrophila, Estrella lausannensis and Parachlamydia acanthamoebae. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 339-345 (2011).
- Fry, N. K., Rowbotham, T. J., Saunders, N. A., Embley, T. M. Direct amplification and sequencing of the 16S ribosomal DNA of an intracellular Legionella species recovered by amoebal enrichment from the sputum of a patient with pneumonia. FEMS Microbiol. Lett. 67, 165-168 (1991).
- Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila serogroup 1 from human feces with use of amebic cocultures. Clin. Infect. Dis. 26, 502-503 (1998).
- Greub, G., La Scola, B., Raoult, D. Amoebae-resisting bacteria isolated from human nasal swabs by amoebal coculture. Emerging Infect. Dis. 10, 470-477 (2004).
- Isenberg, H. D. . Clinical microbiology procedures handbook. , (1992).
- Gimenez, D. F. Staining Rickettsiae in Yolk-Sac Cultures. Stain Technol. 39, 135-140 (1964).
- Thomas, V., Herrera-Rimann, K., Blanc, D. S., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-resisting bacteria in a hospital water network. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2428-2438 (2006).
- Miyamoto, H., et al. Development of a new seminested PCR method for detection of Legionella species and its application to surveillance of legionellae in hospital cooling tower water. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2489-2494 (1997).
- Lienard, J., et al. Development of a new chlamydiales-specific real-time PCR and its application to respiratory clinical samples. J. Clin. Microbiol. 49, 2637-2642 (2011).
- Wang, Y., Ogawa, M., Fukuda, K., Miyamoto, H., Taniguchi, H. Isolation and identification of mycobacteria from soils at an illegal dumping site and landfills in Japan. Microbiol. Immunol. 50, 513-524 (2006).
- Corsaro, D., Pages, G. S., Catalan, V., Loret, J. F., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-associated bacteria in water treatment plants. Int. J. Hygiene Environ. Health. 213, 158-166 (2010).
- La Scola, B., et al. Legionella drancourtii sp. nov., a strictly intracellular amoebal pathogen. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 699-703 (2004).
- Thomas, V., Casson, N., Greub, G. New Afipia and Bosea strains isolated from various water sources by amoebal co-culture. Syst. Appl. Microbiol. 30, 572-579 (2007).
- La Scola, B., et al. Amoeba-resisting bacteria and ventilator-associated pneumonia. Emerging Infect. Dis. 9, 815-821 (2003).
- Collingro, A., et al. Recovery of an environmental Chlamydia strain from activated sludge by co-cultivation with Acanthamoeba sp. Microbiology. 151, 301-309 (2005).
- Lienard, J., Croxatto, A., Prod’hom, G., Greub, G. Estrella lausannensis, a new star in the Chlamydiales order. Microbes Infect. 13, 1232-1241 (2011).
- La Scola, B., et al. A giant virus in amoebae. Science. 299, 2033 (2003).
- Boyer, M., et al. Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21848-21853 (2009).
- Thomas, V., et al. Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets. Environ. Microbiol. 13, 1454-1466 (2011).
- Raoult, D., Renesto, P., Brouqui, P. Laboratory infection of a technician by mimivirus. Ann. Internal Med. 144, 702-703 (2006).
- Greub, G. Parachlamydia acanthamoebae, an emerging agent of pneumonia. Clin. Microbiol. Infect. 15, 18-28 (2009).
- Lamoth, F., Greub, G. Amoebal pathogens as emerging causal agents of pneumonia. FEMS Microbiol. Rev. 34, 260-280 (2010).
- Lienard, J. G., Ashbolt, K., Sen, N. J. Ch. 6. Environmental microbiology, current technology and water applications. , 143-162 (2011).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ. Microbiol. , (2012).
- Ovrutsky, A. R., et al. Cooccurrence of Free-Living Amoebae and Nontuberculous Mycobacteria in Hospital Water Networks, and Preferential Growth of Mycobacterium avium in Acanthamoeba lenticulata. Appl. Environ. Microbiol. 79, 3185-3192 (2013).
