Amoebal cokultur er en cellekultur-system ved hjælp af klæbende amøber til selektivt at vokse intracellulære patogener stand til at modstå fagocytiske celler, såsom amøber og makrofager. Det udgør derfor et vigtigt redskab til at opdage nye smitstoffer. Amoebal berigelse tillader opdagelsen af nye amoebal arter og deres specifikke intracellulære bakterier.
Intracellulære patogener, såsom Legionella, mykobakterier og klamydia-lignende organismer er vanskelige at isolere, fordi de ofte vokser dårligt eller slet ikke på selektive medier, der normalt bruges til at dyrke bakterier. Af denne grund blev mange af disse patogener opdagede først for nylig eller efter vigtige udbrud. Disse patogener er ofte forbundet med amøber, der tjener som værtscelle og tillade overlevelse og vækst af bakterierne. Vi agter her for at give en demonstration af to teknikker, der tillader isolering og karakterisering af intracellulære patogener til stede i kliniske eller miljøprøver: den amoebal cokultur og amoebal berigelse. Amoebal cokultur tillader genvinding af intracellulære bakterier ved podning den undersøgte prøve på en amoebal græsplæne, der kan være inficeret og lyseres ved de intracellulære bakterier til stede i prøven. Amoebal berigelse tillader inddrivelse af amøber til stede i et klinisk eller miljømæssige prøve. Ther kan føre til opdagelsen af nye amoebal arter, men også nye intracellulære bakterier vokser specifikt i disse amøber. Tilsammen udgør disse to teknikker bidrage til at opdage nye intracellulære bakterier i stand til at vokse i amøber. På grund af deres evne til at inficere amøber og modstå fagocytose, kan disse intracellulære bakterier også undslippe fagocytose af makrofager og dermed være patogen for højere eukaryoter.
Før fremkomsten af molekylær diagnose blev tilstedeværende mikroorganismer i miljøet nicher eller i kliniske prøver ofte detekteres ved at dyrke dem på forskellige selektive medier, hovedsagelig på agar i Petri-skåle. Fænotype de bakterielle kolonier og deres metaboliske aktivitet tilladt så bakteriel klassificering på artsniveau. Bouillon kan også anvendes til at øge følsomheden af detektion. Men begge teknikker tillader ikke inddrivelse af bakterier, der vokser langsomt eller slet ikke på disse medier. Dette er grunden til, molekylære metoder er så udbredt i dag. Ikke desto mindre, påvisning af DNA giver ingen anelse om levedygtigheden af bakterierne. Desuden Modsat til kultur, molekylære metoder ikke resulterer i en stamme, der kan yderligere beskrives.
Studere patogener, der vokser dårligt på faste medier eller det behov celler til at vokse, er kompliceret. De fleste af disse "vanskelige at dyrke" bakterier er kræsen intracellulære bakterier, ofte opdaget og karakteriseret efter store udbrud, som det var tilfældet for Legionella pneumophila. Denne bakterie blev karakteriseret efter et udbrud, der fandt sted under en American Legion konvention. Så mange som 182 personer blev smittet, og 29 døde på grund af en alvorlig lungebetændelse 1,2. Det blev senere vist, at amøber var selvskrevne til denne bakterie, og at deres tilstedeværelse i hotelsiden air-conditioning system og vand-net var på oprindelsen af udbruddet af den såkaldte legionærsyge 3.
Amøber er til stede over hele verden og er blevet isoleret fra jord, luft, vand og næseslimhinden af humane frivillige (revideret i 4). Disse "fritlevende" amøber generelt dividere autonomt i miljøet, men kan lejlighedsvis invadere eftergivende værter 5. Amøber foder på forskellige mikroorganismer gennem fagocytose og efterfølgende lysosomal fordøjelse af hydrolases 6.. Mange fakultative eller som forpligter intracellulære bakterier er i stand til at modstå fordøjelsen og dermed inficere og dividere i amøber som for eksempel Legionella, Chlamydia-relaterede bakterier eller mykobakterier (revideret i 7 og 8). Fritlevende amøber udgør sandsynligvis en vigtig potentiel reservoir for intracellulære bakterier, der endnu ikke er blevet opdaget. Dette førte vores gruppe at gennemføre i Lausanne to vigtigste teknikker, kaldet amoebal cokultur og amoebal berigelse, som tillod forskellige grupper til at isolere flere nye obligat intracellulære mikroorganismer fra forskellige miljøprøver 9-15.
Da amøber er professionelle fagocytter græsser på bakterier, kan en bakterie i stand til at modstå fagocytose og vokse inde i disse protister også kolonisere humane fagocytter og være patogene over for mennesker. Dette blev delvist påvist for nogle chlamydia-relaterede bakterier, såsom Waddlia chondrophila. W. chondrophila kan vokse ikke kun i amøber, men også i flere celletyper, såsom mammale epitelceller, makrofager og fisk cellelinier 16-18. Den amoebal cokultur vises også relevant for at detektere intracellulære bakterier i kliniske prøver 19,20, herunder afføring, som er stærkt forurenet med forskellige bakteriearter 21.
Her beskriver vi de vigtigste trin i amoebal cokultur og amoebal berigelse, herunder (a) behandling af miljø-eller kliniske prøver (b) væksten i amøber på axeniske medierne og på en bakteriel plæne af Escherichia coli og (c) udvælgelse og karakterisering af intracellulære bakterier.
Amoebal cokultur og amoebal berigelse er effektive metoder, der tillod isolering af mange nye bakterie-og amoebal arter. Resultater opnået med disse metoder bekræfter den allestedsnærværende tilstedeværelsen af både amøber og amøber-modstand bakterier i miljøet, og mest interessant i menneskeskabte vandnet, der anses for at være kontrolleret af kemiske behandlinger såsom kloring og ozon. Amoebal cokultur og amoebal berigelse er vigtige redskaber til at isolere og dyrke disse potentielt patogene mikroorg…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Pr. Bernard La Scola for nyttige tekniske råd og interessant diskussion om amoebal cokultur og amoebal berigelse. Vi takker også Dr. Vincent Thomas for hans hjælp i gennemførelsen af teknikken i vores laboratorium.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 108342 | |
0.22 μm pore size membrane | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCVPU11RE | |
proteose peptone | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 211693 | |
yeast extract | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 212750 | |
Cell culture flasks | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 353135 | |
Kova slide | Hycor, Indianapolis, IN | 87144 | |
cell culture microplates | Corning Inc, Corning, NY | 3524 | |
Diff-Quik staining kit | Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany | 130832 | |
Ziehl fuchsin | Fluka, St-Louis, MI | 21820 | |
basic fuchsin | Sigma, St-Louis, MI | 857843 | |
Phenol | Sigma, St-Louis, MI | P1037 | Corrosive and mutagenic |
malachite green oxalate | Fluka, St-Louis, MI | 63160 | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15710 | |
Saponin | Sigma, St-Louis, MI | 84510 |