JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Immunology and Infection

Opdagelsen af ​​nye intracellulære patogener af Amoebal cokultur og Amoebal Enrichment Approaches

Published: October 27, 2013
doi:
10.3791/51055
, , ,
1Institute of Microbiology,University Hospital Center and University of Lausanne

Summary

Amoebal cokultur er en cellekultur-system ved hjælp af klæbende amøber til selektivt at vokse intracellulære patogener stand til at modstå fagocytiske celler, såsom amøber og makrofager. Det udgør derfor et vigtigt redskab til at opdage nye smitstoffer. Amoebal berigelse tillader opdagelsen af ​​nye amoebal arter og deres specifikke intracellulære bakterier.

Abstract

Intracellulære patogener, såsom Legionella, mykobakterier og klamydia-lignende organismer er vanskelige at isolere, fordi de ofte vokser dårligt eller slet ikke på selektive medier, der normalt bruges til at dyrke bakterier. Af denne grund blev mange af disse patogener opdagede først for nylig eller efter vigtige udbrud. Disse patogener er ofte forbundet med amøber, der tjener som værtscelle og tillade overlevelse og vækst af bakterierne. Vi agter her for at give en demonstration af to teknikker, der tillader isolering og karakterisering af intracellulære patogener til stede i kliniske eller miljøprøver: den amoebal cokultur og amoebal berigelse. Amoebal cokultur tillader genvinding af intracellulære bakterier ved podning den undersøgte prøve på en amoebal græsplæne, der kan være inficeret og lyseres ved de intracellulære bakterier til stede i prøven. Amoebal berigelse tillader inddrivelse af amøber til stede i et klinisk eller miljømæssige prøve. Ther kan føre til opdagelsen af ​​nye amoebal arter, men også nye intracellulære bakterier vokser specifikt i disse amøber. Tilsammen udgør disse to teknikker bidrage til at opdage nye intracellulære bakterier i stand til at vokse i amøber. På grund af deres evne til at inficere amøber og modstå fagocytose, kan disse intracellulære bakterier også undslippe fagocytose af makrofager og dermed være patogen for højere eukaryoter.

Introduction

Før fremkomsten af ​​molekylær diagnose blev tilstedeværende mikroorganismer i miljøet nicher eller i kliniske prøver ofte detekteres ved at dyrke dem på forskellige selektive medier, hovedsagelig på agar i Petri-skåle. Fænotype de bakterielle kolonier og deres metaboliske aktivitet tilladt så bakteriel klassificering på artsniveau. Bouillon kan også anvendes til at øge følsomheden af ​​detektion. Men begge teknikker tillader ikke inddrivelse af bakterier, der vokser langsomt eller slet ikke på disse medier. Dette er grunden til, molekylære metoder er så udbredt i dag. Ikke desto mindre, påvisning af DNA giver ingen anelse om levedygtigheden af ​​bakterierne. Desuden Modsat til kultur, molekylære metoder ikke resulterer i en stamme, der kan yderligere beskrives.

Studere patogener, der vokser dårligt på faste medier eller det behov celler til at vokse, er kompliceret. De fleste af disse "vanskelige at dyrke" bakterier er kræsen intracellulære bakterier, ofte opdaget og karakteriseret efter store udbrud, som det var tilfældet for Legionella pneumophila. Denne bakterie blev karakteriseret efter et udbrud, der fandt sted under en American Legion konvention. Så mange som 182 personer blev smittet, og 29 døde på grund af en alvorlig lungebetændelse 1,2. Det blev senere vist, at amøber var selvskrevne til denne bakterie, og at deres tilstedeværelse i hotelsiden air-conditioning system og vand-net var på oprindelsen af udbruddet af den såkaldte legionærsyge 3.

Amøber er til stede over hele verden og er blevet isoleret fra jord, luft, vand og næseslimhinden af humane frivillige (revideret i 4). Disse "fritlevende" amøber generelt dividere autonomt i miljøet, men kan lejlighedsvis invadere eftergivende værter 5. Amøber foder på forskellige mikroorganismer gennem fagocytose og efterfølgende lysosomal fordøjelse af hydrolases 6.. Mange fakultative eller som forpligter intracellulære bakterier er i stand til at modstå fordøjelsen og dermed inficere og dividere i amøber som for eksempel Legionella, Chlamydia-relaterede bakterier eller mykobakterier (revideret i 7 og 8). Fritlevende amøber udgør sandsynligvis en vigtig potentiel reservoir for intracellulære bakterier, der endnu ikke er blevet opdaget. Dette førte vores gruppe at gennemføre i Lausanne to vigtigste teknikker, kaldet amoebal cokultur og amoebal berigelse, som tillod forskellige grupper til at isolere flere nye obligat intracellulære mikroorganismer fra forskellige miljøprøver 9-15.

Da amøber er professionelle fagocytter græsser på bakterier, kan en bakterie i stand til at modstå fagocytose og vokse inde i disse protister også kolonisere humane fagocytter og være patogene over for mennesker. Dette blev delvist påvist for nogle chlamydia-relaterede bakterier, såsom Waddlia chondrophila. W. chondrophila kan vokse ikke kun i amøber, men også i flere celletyper, såsom mammale epitelceller, makrofager og fisk cellelinier 16-18. Den amoebal cokultur vises også relevant for at detektere intracellulære bakterier i kliniske prøver 19,20, herunder afføring, som er stærkt forurenet med forskellige bakteriearter 21.

Her beskriver vi de vigtigste trin i amoebal cokultur og amoebal berigelse, herunder (a) behandling af miljø-eller kliniske prøver (b) væksten i amøber på axeniske medierne og på en bakteriel plæne af Escherichia coli og (c) udvælgelse og karakterisering af intracellulære bakterier.

Protocol

1.. Amoebal cokultur 1.1 Prøveforberedelse Miljøprøve Vandprøver Prøven vand (500 ml til 1 liter) filtreres gennem et 0,22 um porestørrelse membran. Derefter ryste membranen i sidens amøbe saltvandsmedium PAS (120 mg NaCl, 4 mg MgSO4 • 7H 2 O, 4 mg CaCl2 • 2H 2 O, 142 mg Na 2 HPO 4, og 136 mg af KH 2 PO 4 i 1 liter destilleret vand). </l…

Representative Results

Brug amoebal cokultur og amoebal berigelse, blev en lang række miljø-og / eller sygdomsfremkaldende bakterier opdaget (tabel 1). Amoebal cokultur blev brugt af vores gruppe og andre til at analysere miljøprøver, vandbehandlingsanlæg og vand distributionssystemer. En bred vifte af mikroorganismer kunne isoleres med denne teknik. De mest almindelige bakterier isoleret ved amoebal cokultur er medlemmer af Mycobacterium slægten, der kan inddrives fra rensningsanl?…

Discussion

Amoebal cokultur og amoebal berigelse er effektive metoder, der tillod isolering af mange nye bakterie-og amoebal arter. Resultater opnået med disse metoder bekræfter den allestedsnærværende tilstedeværelsen af ​​både amøber og amøber-modstand bakterier i miljøet, og mest interessant i menneskeskabte vandnet, der anses for at være kontrolleret af kemiske behandlinger såsom kloring og ozon. Amoebal cokultur og amoebal berigelse er vigtige redskaber til at isolere og dyrke disse potentielt patogene mikroorg…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Pr. Bernard La Scola for nyttige tekniske råd og interessant diskussion om amoebal cokultur og amoebal berigelse. Vi takker også Dr. Vincent Thomas for hans hjælp i gennemførelsen af ​​teknikken i vores laboratorium.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Glucose monohydrate Merck, Darmstadt, Germany 108342
0.22 μm pore size membrane Merck Millipore, Darmstadt, Germany SCVPU11RE
proteose peptone Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 211693
yeast extract Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 212750
Cell culture flasks Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 353135
Kova slide Hycor, Indianapolis, IN 87144
cell culture microplates Corning Inc, Corning, NY 3524
Diff-Quik staining kit Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany 130832
Ziehl fuchsin Fluka, St-Louis, MI 21820
basic fuchsin Sigma, St-Louis, MI 857843
Phenol Sigma, St-Louis, MI P1037 Corrosive and mutagenic
malachite green oxalate Fluka, St-Louis, MI 63160
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 15710
Saponin Sigma, St-Louis, MI 84510
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fraser, D. W., et al. Legionnaires’ disease: description of an epidemic of pneumonia. New Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).
  2. McDade, J. E., et al. Legionnaires’ disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease. New Engl. J. Med. 297, 1197-1203 (1977).
  3. Rowbotham, T. J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae. J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).
  4. Rodriguez-Zaragoza, S. Ecology of free-living amoebae. Crit. Rev. Microbiol. 20, 225-241 (1994).
  5. Booton, G. C., Visvesvara, G. S., Byers, T. J., Kelly, D. J., Fuerst, P. A. Identification and distribution of Acanthamoeba species genotypes associated with nonkeratitis infections. J Clin. Microbiol. 43, 1689-1693 (2005).
  6. Brussow, H. Bacteria between protists and phages: from antipredation strategies to the evolution of pathogenicity. Molecular microbiology. 65, 583-589 (2007).
  7. Greub, G., Raoult, D. Microorganisms resistant to free-living amoebae. Clin. Microbiol. Rev. 17, 413-433 (2004).
  8. Thomas, V., McDonnell, G., Denyer, S. P., Maillard, J. Y. Free-living amoebae and their intracellular pathogenic microorganisms: risks for water quality. FEMS Microbiol Rev. 34, 231-259 (2010).
  9. Birtles, R. J., Rowbotham, T. J., Storey, C., Marrie, T. J., Raoult, D. Chlamydia-like obligate parasite of free-living amoebae. Lancet. 349, 925-926 (1997).
  10. Amann, R., et al. Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia spp. Appl. Environ. Microbiol. 63, 115-121 (1997).
  11. Birtles, R. J., et al. Candidatus Odyssella thessalonicensis’ gen. nov., sp. nov., an obligate intracellular parasite of Acanthamoeba species. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 63-72 (2000).
  12. Thomas, V., Casson, N., Greub, G. Criblamydia sequanensis, a new intracellular Chlamydiales isolated from Seine river water using amoebal co-culture. Environ. Microbiol. 8, 2125-2135 (2006).
  13. Pagnier, I., Raoult, D., La Scola, B. Isolation and identification of amoeba-resisting bacteria from water in human environment by using an Acanthamoeba polyphaga co-culture procedure. Environ. Microbiol. 10, 1135-1144 (2008).
  14. Thomas, V., Loret, J. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environ. Microbiol. 10, 2728-2745 (2008).
  15. Corsaro, D., et al. Novel Chlamydiales strains isolated from a water treatment plant. Environ. Microbiol. 11, 188-200 (2009).
  16. Goy, G., Croxatto, A., Greub, G. Waddlia chondrophila enters and multiplies within human macrophages. Microbes Infect. 10, 556-562 (2008).
  17. Kebbi-Beghdadi, C., Cisse, O., Greub, G. Permissivity of Vero cells, human pneumocytes and human endometrial cells to Waddlia chondrophila. Microbes Infect. 13, 566-574 (2011).
  18. Kebbi-Beghdadi, C., Batista, C., Greub, G. Permissivity of fish cell lines to three Chlamydia-related bacteria: Waddlia chondrophila, Estrella lausannensis and Parachlamydia acanthamoebae. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 339-345 (2011).
  19. Fry, N. K., Rowbotham, T. J., Saunders, N. A., Embley, T. M. Direct amplification and sequencing of the 16S ribosomal DNA of an intracellular Legionella species recovered by amoebal enrichment from the sputum of a patient with pneumonia. FEMS Microbiol. Lett. 67, 165-168 (1991).
  20. Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila serogroup 1 from human feces with use of amebic cocultures. Clin. Infect. Dis. 26, 502-503 (1998).
  21. Greub, G., La Scola, B., Raoult, D. Amoebae-resisting bacteria isolated from human nasal swabs by amoebal coculture. Emerging Infect. Dis. 10, 470-477 (2004).
  22. Isenberg, H. D. . Clinical microbiology procedures handbook. , (1992).
  23. Gimenez, D. F. Staining Rickettsiae in Yolk-Sac Cultures. Stain Technol. 39, 135-140 (1964).
  24. Thomas, V., Herrera-Rimann, K., Blanc, D. S., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-resisting bacteria in a hospital water network. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2428-2438 (2006).
  25. Miyamoto, H., et al. Development of a new seminested PCR method for detection of Legionella species and its application to surveillance of legionellae in hospital cooling tower water. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2489-2494 (1997).
  26. Lienard, J., et al. Development of a new chlamydiales-specific real-time PCR and its application to respiratory clinical samples. J. Clin. Microbiol. 49, 2637-2642 (2011).
  27. Wang, Y., Ogawa, M., Fukuda, K., Miyamoto, H., Taniguchi, H. Isolation and identification of mycobacteria from soils at an illegal dumping site and landfills in Japan. Microbiol. Immunol. 50, 513-524 (2006).
  28. Corsaro, D., Pages, G. S., Catalan, V., Loret, J. F., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-associated bacteria in water treatment plants. Int. J. Hygiene Environ. Health. 213, 158-166 (2010).
  29. La Scola, B., et al. Legionella drancourtii sp. nov., a strictly intracellular amoebal pathogen. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 699-703 (2004).
  30. Thomas, V., Casson, N., Greub, G. New Afipia and Bosea strains isolated from various water sources by amoebal co-culture. Syst. Appl. Microbiol. 30, 572-579 (2007).
  31. La Scola, B., et al. Amoeba-resisting bacteria and ventilator-associated pneumonia. Emerging Infect. Dis. 9, 815-821 (2003).
  32. Collingro, A., et al. Recovery of an environmental Chlamydia strain from activated sludge by co-cultivation with Acanthamoeba sp. Microbiology. 151, 301-309 (2005).
  33. Lienard, J., Croxatto, A., Prod’hom, G., Greub, G. Estrella lausannensis, a new star in the Chlamydiales order. Microbes Infect. 13, 1232-1241 (2011).
  34. La Scola, B., et al. A giant virus in amoebae. Science. 299, 2033 (2003).
  35. Boyer, M., et al. Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21848-21853 (2009).
  36. Thomas, V., et al. Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets. Environ. Microbiol. 13, 1454-1466 (2011).
  37. Raoult, D., Renesto, P., Brouqui, P. Laboratory infection of a technician by mimivirus. Ann. Internal Med. 144, 702-703 (2006).
  38. Greub, G. Parachlamydia acanthamoebae, an emerging agent of pneumonia. Clin. Microbiol. Infect. 15, 18-28 (2009).
  39. Lamoth, F., Greub, G. Amoebal pathogens as emerging causal agents of pneumonia. FEMS Microbiol. Rev. 34, 260-280 (2010).
  40. Lienard, J. G., Ashbolt, K., Sen, N. J. Ch. 6. Environmental microbiology, current technology and water applications. , 143-162 (2011).
  41. Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ. Microbiol. , (2012).
  42. Ovrutsky, A. R., et al. Cooccurrence of Free-Living Amoebae and Nontuberculous Mycobacteria in Hospital Water Networks, and Preferential Growth of Mycobacterium avium in Acanthamoeba lenticulata. Appl. Environ. Microbiol. 79, 3185-3192 (2013).

Tags

Intracellular PathogensLegionellaMycobacteriaChlamydia-like OrganismsAmoebaeAmoebal CocultureAmoebal EnrichmentIsolationCharacterizationClinical SamplesEnvironmental SamplesBacterial GrowthPhagocytosisMacrophagesPathogenic
check_url/51055?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches. J. Vis. Exp. (80), e51055, doi:10.3791/51055 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image