The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol, developed for the honey bee (Apis mellifera), provides an ecologically-relevant and easily quantifiable means for studying several different mechanisms of learning in many insect species.
Insekter endre sine svar på stimuli gjennom erfaring med å knytte disse stimuli med hendelser som er viktige for overlevelse (f.eks mat, styrmenn, trusler). Det er flere atferdsmekanismer gjennom som et insekt lærer fremtredende foreninger og relaterer dem til disse hendelsene. Det er viktig å forstå dette atferds plastisitet for programmer rettet mot å bistå insekter som er gunstig for landbruket. Denne forståelsen kan også brukes for å oppdage løsninger på biomedisinske og landbruks problemene skapt av insekter som opptrer som sykdom vektorer og skadedyr. Snabel Extension Response (PER) condition-protokollen ble utviklet for honningbier (Apis mellifera) over 50 år siden for å studere hvordan de oppfatter og lære om floral lukt, som signalet nektar og pollen ressurser en koloni behov for å overleve. Den PER prosedyren gir en robust og enkel å ansette rammeverk for å studere flere forskjellige økologisk relevant mechanismer av atferds plastisitet. Det er lett å tilpasse for bruk med flere andre insektarter og andre adferds reflekser. Disse protokoller kan lett anvendes i forbindelse med forskjellige anordninger for å overvåke nevral aktivitet i CNS via elektro eller Bioimaging, eller for å manipulere målrettede neuromodulatory trasé. Det er en robust assay for hurtig påvisning av sub-letale effekter på oppførsel skyldes miljømessige stressfaktorer, toksiner eller plantevernmidler.
Vi viser hvordan PER protokollen er grei å gjennomføre ved hjelp av to prosedyrer. En er egnet som et laboratorium øvelse for elevene eller for raske analyser av effekten av en eksperimentell behandling. Det andre gir mer grundig kontroll av variabler, som er viktig for studier av adferdskondisjonering. Vi viser hvordan flere tiltak for atferdsrespons som strekker seg fra binære ja / nei til mer kontinuerlig variabel som ventetid og varigheten av snabel forlengelse kan brukes til å teste hypotheses. Og vi diskutere noen fallgruver at forskere ofte støter på når de bruker prosedyren for første gang.
Mange insekter lære om økologisk relevante stimuli, og de deretter endre sine atferdsmessige reaksjoner på disse stimuli for å tilpasse seg nye prediktive relasjoner i deres miljø. Flere ulike mekanismer kan ligge til grunn for denne atferds plastisitet (f.eks nonassociative, assosiativ / Pavlovian, og operant / instrumental 1). Disse typer plastisitet varierer i hvordan de stimuli eller atferd er forbundet med viktige hendelser, for eksempel forekomsten av mat, en kompis, eller fare. Forstå disse formene for plastisitet er svært viktig for grunnleggende forskning på hvordan nervesystemet endrer å kode nye minner to. Det er også viktig for å forstå de adaptive atferd av insekter som er viktige vektorer for sykdom (f.eks tsetse og mygg) og insekter som er landbruksmessig viktig, enten i planteproduksjon (honningbier) eller som skadedyr.
Studerer atferds plastisitet i noen animal krever et nivå på eksperimentell kontroll over en rekke variabler som ikke er oppnåelig i felt 1.. Det krever utviklingen av en robust kondisjone protokoll som kan benyttes under mer kontrollerte betingelser, men som fremdeles er relevant for problemet under naturlige betingelser. Honey Bee (Apis mellifera) er en utmerket modell for hvordan man kan utvikle en protokoll for å utføre kontrollerte analyser av atferds plastisitet 3,4. Snabel Extension Response (PER) på honningbier er en naturlig atferds refleks hvori honningbie utvider proboscis som reaksjon på antennal stimulering med en sukkeroppløsning. Under normal foraging atferd, oppstår PER når honningbie finner nektar i en blomst. Heldigvis vil honningbier lett oppviser denne enkle og lett å kvantifisere oppførsel i laboratoriet. Dette gjør det mulig å studere, i en kontrollert setting, hvilke mekanismer som påvirker dette økologisk relevant atferd fem. PER can også brukes innen en condition-protokollen for å undersøke stimulans persepsjon og læring og hukommelse under ulike behandlingsforhold, som er designet for å avsløre de atferdsmessige og nevrale mekanismer som ligger til grunn for plastisitet seks.
Siden de første studiene av Kuwabara 7, har PER conditioning vært mye brukt for å avsløre nonassociative, assosiativ og operante mekanismer som ligger til grunn for atferds plastisitet i honningbier åtte. Disse mekanismene er identiske med de avslørt i studier av fritt flyr honningbier ni. I motsetning til studier av fritt flyr honningbier, kan PER condition protokoller være kombinert med elektrofysiologi 10,11 eller live-cell fluorescens bildebehandling 12-14 av hjernen. Videre PER protokollene tillater for eksperimentell manipulering av nervebaner via farmakologiske eller molekylærgenetiske behandlinger for å teste hypoteser om rollene til bestemte komponenter i nettverket, for eksempel NEURomodulators 15,16. PER protokoller har også gitt en viktig måte å evaluere sublethal effektene av miljømessige forhold samt giftstoffer på helse og beite effektiviteten av honningbier 17.
Denne prosedyren beskriver to lukt leveringsmetoder i parallell. Metode 1 er en versjon av lukt og ubetinget stimulus (sukrose) leveranse som gir en rimelig og teknisk enkel metode for å presentere lukt og sukrose belønning. Denne metoden er bra for grunnleggende opplæring og når automatisering er ikke mulig. Det er en utmerket måte å introdusere denne teknikken til et klasserom eller undervisning laboratorium. Under condition for forsøk med vanskeligere oppgaver og kombinert fysiologiske vurderinger av lukt persepsjon, læring, eller minne, er det svært viktig å nøyaktig og presist regulere utbruddet, varighet levering timing av stimuli. For de mest pålitelige stimulans levering, bruke et middel for å automatisere lukt levering ennd en nøyaktig metode for belønning levering. Metode 2 benytter automatisert lukt levering og mer presis sukrose levering. Det er teknisk mer avansert og krever mer for det første oppsettet enn metode 1, men det øker konsistensen av timing og mengde stimuli som brukes for condition og bør brukes når det er mulig.
Denne protokollen presenterte to pålitelige metoder for condition bruker PER prosedyre. Dette er to av flere metoder som har blitt ansatt 27, 21. Vi ansetter Metode 2 for alle eksperimentelle studier med PER som det er konsekvent pålitelig, også på tvers av ulike forskere.
Den samme grunnleggende prosedyren er tilpasset mange ulike typer studier med honningbier, inkludert bruk av ulike condition stimuli og ulike atferds reflekser. Det har også vært knyttet til undersøkelser av genetisk grunnlag av forskjeller i lærings 28,29, de fysiologiske korrelater olfactory persepsjon og hukommelse i hjernen 13,14,30, og de regulerende og molekylærgenetiske baser for atferd 15,16,31 . På grunn av avansert kunnskap om den økologiske betydningen av lukte læring til honningbier, som startet med de første studiene av Karl von Frisch over 100 år siden <sup> 31, kan resultatene fra PER lett knyttes til overlevelses behovene til en koloni. I det siste har det blitt tilpasset et jordbruks studie for å undersøke sublethal atferdsmessige effekter av plantevernmidler og miljøgifter 17.
Den grunnleggende prosedyren er kraftig ved at den kan anvendes for å undersøke problemer i andre arter også. To møll arter, Manduca Sexta og Spodoptera littoralis, har blitt brukt i PER studier for å undersøke nevrale grunnlaget for lukt identifikasjon og hver art 'luktelærings evner 32,33. PER eksperimenter med fruktfluer har gitt mange innsikt i de molekylære signal kaskader involvert i chemosensation og læring 34. Og PER har nylig blitt brukt til å studere tilvenning i loppe (Rhodnius prolixus) 35, en viktig sykdom vektor.
Generelt er fremgangsmåten robust for endringer i metoden; bruken av different metoder vil sannsynligvis produsere den samme relative forskjellen mellom behandlingsgruppene. Til tross for den relativt enkle prosedyren, kan flere problemer til tider forhindrer honningbier lære lukt-sukrose krets. Følgende tema er mulige endringer i protokollen, og noen av de vanligste problemene som kan oppstå under PER condition.
Vurderinger knyttet til antall og type Trials i Conditioning Protocol
Enhver lærings protokollen krever eksponering av biene i et antall forsøk i anskaffelse fase. Dette antallet avhenger i stor grad på vanskeligheten av oppgaven. Honningbier kan lære en enkel oppgave etter en enkelt studie, men de trenger minst en tre forsøk for å indusere langtidshukommelsen formasjon. Som forventet, vil de honningbier krever betydelig flere forsøk å tilstrekkelig lære en vanskelig oppgave. Vanligvis er det et maksimalt antall forsøk utover som biene ikke lenger er signifikant bedreir ytelse. Dette maksimum avhenger av den spesifikke oppgave, hvilke lukt og konsentrasjoner, og sukrose-konsentrasjon.
Når du bruker mer enn én type forsøk med forskjellige lukter, presentere de ulike typer prøve i en pseudo sekvens for å holde bier fra memorere en enkel sekvens av lukt presentasjoner i stedet for å lære forskjellene mellom lukt 36. I disse pseudo sekvenser, må det finnes et likt antall prøver for hver av de lukt typer. Dessuten er sannsynligheten for et forsøk med en lukttypen som innledes med og etterfølges av den samme lukt, eller en hvilken som helst av de andre lukt, må være lik for alle lukt. For to lukt – A og B – bruk følgende rekkefølge: ABBABAAB. Over åtte forsøk hver lukt presenteres fire ganger. Sette sammen identiske sekvenser for å nå ønsket antall forsøk for hver lukt.
Uavhengig av eksperimentell design, er det noen parametere som må værekonstant for å optimalisere læring. Overlappingen mellom CS og USA er avgjørende for effektiv condition. Den inter-rettssaken intervall (Figur 1, Tabell 1) må være konstant og optimaliseres fordi uregelmessighet eller en for kort eller for lang inter-rettssaken intervall i betydelig grad kan påvirke effektiviteten av condition protokoll 1.
Betraktninger om viktigheten av og Design av Behavioral Testing Trials
Responses innspilt i løpet av 'kjøp fase "av et eksperiment, da CS og USA presenteres sammen, kan være nyttig. Men, pass på at de lukt presentasjonsforhold kan variere fra én type prøveversjon til en annen. Under forsterkede studier er lukt etterfulgt av sukrose presentert i forbindelse med en visuell stimulus (bevegelse av anordningen for avgivelse av den dråpe sukrose) som kan påvirke bie respons. Og biene har bare tre andres for å vise en reaksjon (fire sekunder med lukt stimulering minus den ene sek overlapping med sukrose presentasjon, figur 1). Hvis forsøket innebærer biene lære å skille to lukt (f.eks armert og uarmert), den uarmert lukt presentert på alternative studier skjer uten den visuelle stimulus av belønning presentasjon og biene har hele fire sekunder til å svare. Derfor svarene på de to lukt er ikke helt sammenlign under oppkjøpet. Med noen condition-protokollen, ikke stole utelukkende på oppkjøps kurver en. For bedre å kunne fastslå hvilke bier har lært, innføre en serie av uarmerte testforsøk, hvor verken lukt er forsterket, noe som sikrer at testing av alle stimuli foregår under identiske betingelser.
Avhengig av den spesifikke formålet med forsøket, kan testing består av enkeltstående prøvings utprøving av den betingede lukt eller en serie rettssaker med den betingede odeller eller en kombinasjon av de betingede og nye lukter. En enkelt test prøveversjon av den betingede lukt gir en enkel analyse av om bienes huske den betingede lukt. Imidlertid kan responsen på den første testen rettssaken reflektere biene motivasjon nivå samt deres tilbakekalling av den betingede lukt. En serie av test-forsøk, enten en serie av forsøk utryddelse av det kondisjonerte lukt eller en serie av enkle tester av kondisjonert og en eller flere nye lukt, kan også brukes til å vurdere minne. Rekken av utryddelse prøvelser kan vurdere hvor sterkt de bienes huske den betingede foreningen. Jo sterkere tilbakekall større antall forsøk for å slukke betinget reaksjon. En rekke enkle tester av betingede og nye lukter kan også vurdere spesifisiteten biene 'minne om den betingede lukt.
Det er også viktig å pleie og teste både kontroll og behandlede gruppene på de samme tidspunkter. Comparing ytelsen bier snart etter condition til bier holdt for lengre tidsperioder er problematisk på grunn av eksponering for sukrose USA ved å mate biene til metning. For eksempel kan en reduksjon i ytelse etter lange intervaller skyldes minneråte eller det kan være på grunn av endringer i motiverende tilstand og / eller læring indusert av uarmert eksponering for US, slik at resultatene tvetydig. Derfor bør utførelse av en behandlingsgruppe alltid bli bedømt i forhold til en kontrollgruppe avkjølte og testet ved de samme tidspunkter.
Lukt Konsentrasjon og integritet
Det er flere måter som konsentrasjonen og integriteten av lukt (CS) kan bli kompromittert. Den mest utbredte problemet med lukt levering er uttømming av lukt kassetter fra overforbruk (figur 2). Bytte ut patronene 10-12 bruker (hver 2 eller 3-studier med grupper på 5 honningbier) for å unngå denne fallgruven. Det er også viktig å brukeferske kassetter for testforsøk, siden brukte kassetter forskjellig vis kan bli utarmet og dermed presentere ulike luktstimuli. Et annet vanlig problem er lukt patron forurensning som skyldes bruk av kassett for mer enn én lukt uten helt å rense den. En skitten eller forurenset luft flyt kan også utilsiktet innføre ekstra lukte stimulus (aktive kullfiltre kan hindre bakgrunn forurensning). Dette er spesielt problematisk når man kobler til PER condition med målinger av fysiologiske reaksjoner på lukt. Lekk lukt patroner presentere et problem siden de honningbier er utsatt for lukt før rettssaken begynner, noe som reduserer salience av lukt stimulans. Løstsittende på lufttilførselen for lukt levering kan resultere i liten eller ingen lukt levering når ventilen åpnes, kunstig redusere biene respons på den tiltenkte lukt.
Sukroseløsning og ubetinget stimulus (Belønning)
Amount, konsentrasjon og integriteten til sukroseløsning brukt som USA er avgjørende for å lykkes i forsøket. Kondisjonering er en funksjon av mengden og konsentrasjonen av sakkarose-vann-løsning som brukes som den amerikanske 37. Mikrometer sprøyter som brukes i Metode 2 gir mulighet for svært presis (ned til 0,2 mikroliter) kontroll av US levering, og vi anbefaler å bruke dem for begge metodene beskrevet. Bruk av tannpirkere (metode 1) er tilstrekkelig for omstendighetene som de dyre sprøyter ikke kan brukes, for eksempel, i trening store grupper av studenter, arbeid i felten, eller med lavere budsjetter. Forsiktig gjennomføring av metode 1 er bra så lenge timing opprettholdes med regelmessig utskifting av tannpirkere for å unngå opphoping av sukrose (og konsentrasjonen levert). Imidlertid, ved bruk av tannpirkere er det mer vanskelig å nøyaktig kontrollere og beregne mengden og størrelsen av den leverte US, noe som er viktig for kondisjoneringsstudier 1. Konsentrasjonen av sukrose for ågi en tilstrekkelig belønning for å holde biene motivert for å lære den betingede foreningen kan stole på vanskeligheten av oppgaven og biene 'indre tilstand eller tiden av året. De mer vanskelige oppgaver krever en høyere sukroseløsning for bier 'å kunne lære oppgaven. Mold kan oppbygning i sukrose-løsninger selv ved 5 ° C, noe som vil kompromittere integriteten av løsningen, som påvirker biene helse og oppfatning av belønning under eksperimentet. Det er best å erstatte løsningen med få dagers mellomrom.
Presisjon, timing, og konsekvens av CS og oss Levering
Den mest kritiske spørsmålet om riktig gjennomføring av et PER prosedyre, eller for den saks skyld noen condition prosedyren innebærer presisjon, timing og konsistensen av CS og US levering (figur 1). Etterforskerne som er nye til prosedyren ofte er upresise om levering av en eller begge stimuli. ISI ersom ikke klarer å tillate overlapping av CS og US resultere i dårlig kondisjone ytelse. PLS automatiserer et akustisk signal for eksperimentator å levere sukrose 3 sek etter utbruddet av lukt levering. Undersøkere skal holde sukrose / vanndråpen nær bie for rask levering etter at signalet. Disse prosedyrene hjelpe entrain en konsekvent ISI. Plassere en stoppeklokke ved condition arena for praktisk tid plassering av rettssaken samt overvåke bienes tid i arenaen både før og etter levering av stimuli. På den måten ITI s kan være forholdsvis jevn og hele prosedyren kan kjøres ved en kontrollert hastighet. ITI 's som er for korte, for eksempel mindre enn 1 min, eller for lang kan føre til dårlig kondisjone ytelse 1.
Seasonal, miljømessige og kontekstuelle Effekter på Honey Bee Ytelse
Honningbier prestasjoner kan bli betydelig påvirket av sine omgivelserbåde før og under condition. Ofte vil svingningene i temperatur og næringstilgang som kommer med de skiftende årstidene endre biene motivasjon til å lære. Når blomstene står i blomst, til biene motivasjon lære den betingede foreningen i laboratoriet synker 38. Når kolonien er stresset – fra ekstreme temperaturer, matmangel eller sykdomsrelatert stress – biene 'vil vise en reduksjon i deres læring ytelse inne. Honningbier holdes i et fly rom kan lære bra en stund, men det altfor stresset av sykdom og aldring degradere deres læring ytelse over tid. Konteksten under condition kan også redusere biene prestasjoner. Noen overflødige lukt, bevegelse og andre stimuli kan distrahere bee fra de eksperimentelle stimuli. For å unngå dette problemet, opprettholde en rimelig konsistent, forenklet visuell sammenheng.
Genotype og erfaring Påvirker PER Ytelse
<p class = "jove_content"> Honey bee arbeidstakere kan variere betydelig i ytelse på noen conditioning prosedyre på grunn av oppgaven spesialisering, genotype, eller andre miljøfaktorer 20. Derfor er det viktig å standardisere, så mye som mulig, hvilke typer dyr som ble brukt i et eksperiment for å redusere inter-individuell variasjon. I en koloni ledet av en åpen parret dronning, som betyr at hun parret med mange forskjellige droner, vil arbeiderne forskjellig i faderlig genotype. Genetisk bakgrunn kan føre til dramatiske forskjeller i sensorisk respons 39 og læring ytelse 29. Bruke kolonier ledet av queens instrumentelt inseminert med sæd fra én droner 28 reduserer dette interindividuell variasjon.De protokoller som er beskrevet ovenfor, innbefatter en fremgangsmåte for innsamling av honningbie arbeidere fra reiret inngang. Men disse honningbier skiller seg fra hverandre med hensyn til alder og atferdsmessige oppgave. De kan være små (inexperienced) eller eldre (flere erfarne) nitter. De kan være små honningbier gjør sitt første orienterings flyreiser. Eller de kan være vakt bier. For å redusere variabiliteten, markere biene med en hurtigtørkende emalje maling eller merkeskilt enten som de dukker opp som voksne (for å kontrollere for alder) og / eller når de begynner beite (for å kontrollere for erfaring). Så, noen dager senere, samle de merkede bier for condition. Arbeidere som er engasjert i sykepleie adferd kan hentes fra rammene innenfor strukturen. Sykepleiere kan bli positivt identifisert når de setter sine hoder inn i en flokk celle å mate og ta vare på larven inni.
Ved hjelp av Virgin Queens eller Drones for PER Conditioning
I tillegg til arbeideren honningbier, kan jomfrue honey bee dronninger og droner lett betinget i en PER prosedyre for studier som tar sikte på å utvikle genetiske linjer av honningbier som varierer i læring ytelse 28. Virgin dronninger skal samles snart etter they dukke opp fra pupation og plasseres direkte i tilbakehold seletøy uten bedøvelsen. Unge, umodne droner som samles inn fra stamfisk kam inne i kolonien er generelt ikke motivert for å lære. Etter at de har begynt parring fly, droner lett lære PER oppgaver 28. De skal samles som de kommer tilbake fra en paring fly og vedlikeholdes over natten i et lite bur i en koloni som brukes for oppdrett dronninger. Ikke forsøk å utnytte dem dagen før conditioning; de ikke overleve godt i seletøy over natten. Et par timer før condition dronene kan hentes fra merdene og plassert inn i begrensende seletøy uten bedøvelsen.
Konklusjoner
Dette PER prosedyre, i form av metoder, utgjør et utgangspunkt for å lage PER eksperimenter. De fleste PER protokoller vil kreve at prosedyren skissert endres på noen måte å gjennomføre de konkrete målene for forsøket og overnatte flere behandlingsgruppene. Det er lett å implementere. Men riktig implementering krever oppmerksomhet på detaljer og praksis. Når mestret det kan være en kraftig prosedyre for å legge til som et analyseverktøy for flere grunnleggende og anvendt forskning programmer med ulike insektarter.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av midler fra NIH NCRR (R01 RR014166 til BHS), NIH NIDCD (R01 DC011422 BHS co-PI), US Department of Agriculture (J Trumble PI; BH Smith co-PI) og Arizona State University. Midler til verkstedet for å trene studenter (data i figur 4) ble gitt av Science Foundation of Chile.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-1KG | |
Odorant compounds (for example): | For additional examples of odorants, see any of the papers on olfactory processing from the Smith lab | ||
1-hexanol | Sigma-Aldrich | 471402-100ML | |
2-octanone | Sigma-Aldrich | W280208-800G-K | |
heptanol | Sigma-Aldrich | 51778-5ML | |
gerianol | Sigma-Aldrich | 163333-25G | |
nonanal | Sigma-Aldrich | 131210-100ML | |
Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-1L | |
Heavy Mineral Oil | Sigma-Aldrich | 330760-1L | Make sure it’s odorless |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
Scintillation vials | Sigma-Aldrich | Z190535-1PAK | Use a small drill bit to bore a small hole in the cap of the vials |
Bee harness | Custom-made from 0.9 cm diameter plastic soda straws or hard plastic/metal tubing | ||
Duct tape | |||
Kimwipes | Sigma-Aldrich | Z188956-1PAK | |
Wash bottles | Sigma-Aldrich | Z560847-3EA | For the 70% ethanol |
Small fan in mountable housing | |||
Dryer tubing | |||
FOR METHOD 1 ONLY | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
20 ml disposable plastic syringes | Cole-Parmer | WU-07945-18 | |
15 mm filter paper circles | Sigma-Aldrich | Z274844-1PAK | |
Pushpins | |||
Toothpicks | |||
FOR METHOD 2 ONLY | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Gilmont Micrometer syringe, 0.2 mL | Cole-Parmer | EW-07840-00 | |
Gilmont micrometer syringe tip | Cole-Parmer | EW-07841-00 | |
26G 3/8” Leur hub hypodermic needles | Fisher Scientific | 14-826-10 | |
1cc tuberculin syringes (plastic/glass) | Sigma-Aldrich | Z181641-1EA OR Z192090-200EA | glass tuberculin syringes are available, but plastic syringes are much less expensive and will work well for a limited number of uses |
Small rubber/silicone restrictors | Cole-Parmer | EW-95702-02 | Made from 4.8 mm outer diameter silicone tubing or the rubber tips of the 1 cc syringe plungers |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
75 X 100 mm filter paper | Sigma-Aldrich | Z695106-500EA | |
Direct Logic 05 Programmable Logic Controller | Koyo Electronics Industries Co, Ltd | http://www.koyoele.co.jp/ OR english/support/dlc.html#plc | |
1 mm, 4mm & 6 mm inner diameter PVC or silicone tubing | Cole-Parmer | Various | Cole-Parmer has a wide selection of suitable tubing |
Polypropylene connectors & leur fittings | Cole-Parmer | Various | Cole-Parmer has a wide selection of connectors and fittings for many tube sizes |
65-mm Correlated Flowmeter | Cole-Parmer | EW-03216-08 | Aluminum with Glass float; For Liquids and Gases, With Valve |
OR | |||
Tetra Whisper 300 (Tetratek DW96-2) Aquarium Air Pump | Aquacave | AE-TETRA-300 | www.aquacave.com |
LIF series Solenoid Valves for .042 " ID Tubing, Configuration "E" | The Lee Company | LFAA1200118H | Neoprene, 430 SS, 302 SS, 280mWatts http://www.theleeco.com/LEEWEB2.NSF |
PC-Board 12VDC 70dB Piezo Buzzer | RadioShack | 273-074 | www.radioshack.com |